聚合酶链反应.ppt

*RT-PCR操作需注意的问题：1.模版RNA应严格纯化，；2.避免RNA酶污染；3.所用与实验有关的物品，需用0.1％的焦炭酸二乙酯（DEPC)浸泡处理。第32页,共42页，2024年2月25日，星期天*增效PCR（boosterPCR）当扩增少于1000拷贝的模板DNA时会遇到两个问题：一是形成引物二聚体，一是非特异扩增，而特异扩增片段产量降低。对于这种情况，可设置二步PCR，先用较低浓度的引物进行初级PCR，此时由于引物少，形成引物二聚体的可能减少，但它并不影响靶序列的扩增，只是由于引物少产物亦少。约经15～20个循环后补充引物量，以初级PCR产物为模板进行扩增，靶序列的产量将相应增加。第33页,共42页，2024年2月25日，星期天*2.巢式PCR（nestPCR）此时也是进行二步PCR，与上面不同的是，第二级PCR需另行设置反应体系，并应用另外的PCR引物，此时引物的位置位于初级PCR引物的内侧，用初级PCR产物做模板，进行第二步PCR，这样只有初级PCR中特异的扩增片段才能被二级引物扩增。除了达到增效PCR同样的目的外，还提高了最终产物的特异性。第34页,共42页，2024年2月25日，星期天*巢式PCR采用两对引物进行PCR，其中第二对引物位于第一对引物内。P1上P1下P2上P2下P1上P2上第35页,共42页，2024年2月25日，星期天*FirstroundprimersFirstroundPCRSecondroundprimersSecondroundPCRGeneofinterest第36页,共42页，2024年2月25日，星期天*在同一PCR体系中加入数对PCR引物，如果这些引物的退火温度相近，并且所覆盖的区域不重叠，这样的反应体系可同时扩增多个DNA片段。多重PCR常用来检测同一基因的多个外显子的缺失，或在检测缺失设置内对照。3、多重PCR

第37页,共42页，2024年2月25日，星期天*定量PCR测定靶基因的原始拷贝数目前常用Taqman法.该法的原理是:反应底物中加入荧光探针,探针中的荧光基团与淬灭基团距离近,荧光基团发出的荧光被淬灭基团淬灭,随着反应的进行,结合在靶序列上的荧光探针被Taq酶水解,荧光基团发射的荧光,被监测系统接收。据荧光强度,计算靶基因的原始拷贝数.第38页,共42页，2024年2月25日，星期天*实时定量PCR技术原理第39页,共42页，2024年2月25日，星期天*SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的游离的SYBR染料分子不会发射荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。第40页,共42页，2024年2月25日，星期天*原位PCR将组织或细胞固定于玻片上，经消化处理后，在玻片上滴加PCR反应系统，覆盖密封，置入专用的PCR扩增仪，进行PCR反应。PCR反应结束后，用标记的寡核苷酸探针进行原位杂交。用显微镜观察结果。该方法可分辨鉴定带有靶序列的细胞，又可标出靶序列在细胞内的位置。第41页,共42页，2024年2月25日，星期天感谢大家观看第42页,共42页，2024年2月25日，星期天关于聚合酶链反应* 一.概述聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR),又称无细胞克隆技术，是一种特定DNA片段在体外快速扩增的新方法。数小时达107-108倍1985年，Centus公司KaryMullis发明1993年因此获诺贝尔化学奖第2页,共42页，2024年2月25日，星期天*PCR扩增仪第3页,共42页，2024年2月25日，星期天*变性5’3’5’3’3’5’3’5’引物复性3’5’3’5’5’3’3’5’P1P2第4页,共42页，2024年2月25日，星期天*延伸3’5’3’5’5’3’3’5’P1P2再变性第5页,共42页，2024年2月25日，星期天*再复性P1P1P2P2再延伸第6页,共42页，2024年2月25日，星期天*P1P1P2P2短片段以指数形式扩增长片段以线性形式扩增最终主产物片段长度在P1-P2之间第7页,共42页，2024年2月25日，星期天*PCR循环的主要参数：1.预变性：92°C--95°C，2--5mi