聚合酶链反应.ppt

关于聚合酶链反应第1页，共42页，星期日，2025年，2月5日* 一.概述聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR),又称无细胞克隆技术，是一种特定DNA片段在体外快速扩增的新方法。数小时达107-108倍1985年，Centus公司KaryMullis发明1993年因此获诺贝尔化学奖第2页，共42页，星期日，2025年，2月5日*PCR扩增仪第3页，共42页，星期日，2025年，2月5日*变性5’3’5’3’3’5’3’5’引物复性3’5’3’5’5’3’3’5’P1P2第4页，共42页，星期日，2025年，2月5日*延伸3’5’3’5’5’3’3’5’P1P2再变性第5页，共42页，星期日，2025年，2月5日*再复性P1P1P2P2再延伸第6页，共42页，星期日，2025年，2月5日*P1P1P2P2短片段以指数形式扩增长片段以线性形式扩增最终主产物片段长度在P1-P2之间第7页，共42页，星期日，2025年，2月5日*PCR循环的主要参数：1.预变性：92°C--95°C，2--5min2.变性：92°C--95°C，30s-1min3.复性：40°C--60°C，20s--2min4.延伸：70°C--75°C，30s--3min5.总延伸：72°C，7min第8页，共42页，星期日，2025年，2月5日*三、PCR的基本反应步骤变性95?C延伸72?C退火Tm-5?C第9页，共42页，星期日，2025年，2月5日*PCR扩增条件94℃,5min94℃,1min3055℃,1min72℃,1min72℃,7min第10页，共42页，星期日，2025年，2月5日*第11页，共42页，星期日，2025年，2月5日*DNAMarkerNGF←2000bp←1000bp←750bp←500bp←250bp←100bp第12页，共42页，星期日，2025年，2月5日*第13页，共42页，星期日，2025年，2月5日*第14页，共42页，星期日，2025年，2月5日*第15页，共42页，星期日，2025年，2月5日*三.PCR反应体系缓冲液提供所需的pH环境DNA模板：欲扩增的DNA样品dNTP：四种脱氧核苷酸MgCl2：提供Mg++离子引物：根据欲扩增的DNA样品设计耐热的DNA聚合酶：来源于喜热的细菌第16页，共42页，星期日，2025年，2月5日*耐热的DNA聚合酶Taq聚合酶喜温性细菌ThermusaquaticusBM5→3聚合活性5→3外切活性Pwo聚合酶喜温性细菌Pyrococcyswoesei5→3聚合活性3→5外切活性（校正）耐热1000C2小时Tth聚合酶喜温性细菌Thermusthermophilus5→3聚合活性当锰离子存在时具有逆转录酶活性C.therm聚合酶喜温性细菌Thermusthermophilus3→5外切活性（校正）当镁离子存在时具有逆转录酶活性第17页，共42页，星期日，2025年，2月5日*1.PCRbuffer:72?C时，反应体系的pH值下降1个单位，接近于7.2MgCl2－浓度1－2mmol/L，过量引起非特异扩增，不足使酶活性显著降低，导致产物量少；2.三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）：是合成的原料，四种的浓度应相等，浓度一般为50—200μmol／L。第18页，共42页，星期日，2025年，2月5日*3.引物：0.1-1um