聚合酶链反应(PCR)及其应用-格式+动画-终板.ppt

实时荧光PCR外标绝对定量的数学模型 利用已知起始拷贝数的外部标准品可做出标准曲线，在现有实时荧光PCR中，大部分以纵坐标为Ct值，横坐标为起始拷贝数，少部分以纵坐标为起始拷贝数，横坐标为Ct值。 实时荧光PCR外标绝对定量的数学模型 只要获得未知标本的Ct值，即可从标准曲线上计算出该标本的起始拷贝数，这是采用外标进行实时荧光PCR绝对定量的基本原理 基本计算公式的推导 I Yn=X(1+E)n (1) 其中，Yn 为第n个循环后扩增产物的量，X为原模板数，E为扩增效率，n为扩增循环数。 II 在扩增达到阈值线时，此时，n = Ct，于是，扩增产物的量为： YCt=X(1+E)Ct (2) YCt 为荧光信号达到阈值强度时扩增产物的量。在阈值线设定以后，它就是一个常数。 III (2) 式两边同时取对数，得： LogYCt= LogX(1+E)Ct (3) 亦即： LogYCt= LogX+ Ct×Log(1+E) (4) 如果扩增效率为100%，亦即E=1，扩增反应管中原始拷贝数为10，扩增产物达到1000分子拷贝 因此，如果已知原始模板拷贝数为1，扩增产物达1000分子拷贝时，其Ct 6.64较多，则说明扩增效率过低。 则预计的 Ct= × (Log1000-Log10)= ×2 = 6.64。 基本计算公式的推导 实时荧光PCR外标绝对定量的数学模型 纵坐标为Ct值横坐标为起始拷贝数时的数学模型 实时荧光PCR外标绝对定量的数学模型 纵坐标为Ct值横坐标为起始拷贝数时的数学模型 LogX= -Ct×Log(1+E)+LogYCt (5) 可变换为: Ct=(-1/log(1+E))Log X+ Log YCt/log(1+E) (7) A= -1/log(1+E), B= Log YCt / log(1+E) 如果扩增效率为1（100%）， 则斜率A =-1/log2=-3.32 如果扩增效率为0.5(100%)， 则斜率A =-1/log1.5=-5.68 实时荧光PCR外标绝对定量的数学模型 纵坐标为Ct值横坐标为起始拷贝数时的数学模型 此种计算模式下， 斜率A必≤-3.32。 截距B则为原始模板 趋向于0亦阴性标本 检测的Ct 值，因此， 一个实时荧光PCR， 如果设定的扩增 循环数为40，则 其截距B即应≥40。 日常扩增的实时荧光曲线所蕴含的信息 有典型扩增曲线但很弱阳性样本 如何分析患者测定结果 横向分析 主要是与相关检测指标的一致性，HBV DNA与乙肝“两对半”；HCV RNA与抗-HCV、HCV核心抗原；HIV-1 RNA与抗HIV-1/2等。 纵向分析 患者以往相同项目的检测结果 弱阳性样本的重复检测 简单重复 原因探讨性重复 有内标的实时荧光PCR测定的抑制物存在的判断 分子信标实时荧光定量PCR 使用非竞争性内标准的定量PCR方法 1 非竞争性内标准：（1）一般为与靶核酸无关的基因组；（2）既可是内源的也可是外源的；（3）与靶核酸无相同的引物结合位点和扩增序列。 对于DNA的扩增，非竞争性内标几乎所有的基因都可应用，最常用的有丙酮酸脱氢酶、前脑啡肽或β肌动蛋白的基因。 2 3 而对RNA的扩增，则非竞争性内标较难寻找。理想的mRNA内标应该在整个细胞周期中表达的水平变化不大，此外，其表达水平应接近于靶RNA，而且它们的扩增效率应相等，因此两者扩增线性区域是重合的。 已有许多的mRNA被尝试用来作为此种内标，如HLA、β肌动蛋白、GAPDH和组蛋白H3.3的mRNA或14S rRNA等。 4 以非竞争性内标定量的主要优点 复管测定可排除管间差异，并且在一定程度上，可排除样本间的差异。 内标的制备简单 以非竞争性内标定量的缺点 内标准和靶核酸的逆转录的效率有可能不同，并且有可能既使针对的是相同的靶核酸逆转录效率也会有很大差异。因此，使用这种方法进行RNA的定量PCR测定极为困难。 在扩增过程中的指数期测定可对原始模板相对定量，但如果没有验证在一定的扩增周期内靶核酸和内标有相同的扩增效率，则不能进行绝对定量。 使用竞争性内标既可进行相对定量也可进行绝对定量。 相对定量具有很好的精密度和重复性。而绝对定量，关键是要证明竞争性内标和野生型靶核酸的扩增效率相同。亦可将竞争性内标置于含已知量的野生型靶核酸的样本中同时扩增来评价。 “竞争性”内标：人为构建的可与原始靶核酸竞争酶、核苷酸和引物分子的核酸标准，其特点是，与靶核酸具有相同的引物结合位点、但引物之间的顺序需加以修饰，使得扩增产物在检测时能够很容易地通过诸如凝胶电泳、探针杂交或高效液相层析等方法区分。 对内