DB37T 2094-2012 水产品中羟脯氨酸含量的测定 高效液相色谱法.docx
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DB37
山东省地方标准DB37/T2094—2012
水产品中羟脯氨酸含量的测定高效液相色谱法
DeterminationofHydroxyprolineinFisheryProductsbyHighPerformanceLiquidChromatography
2012-03-21发布2012-05-01实施
山东省质量技术监督局发布
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DB37/T2094—2012
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由山东省海洋与渔业厅提出。
本标准由山东省海洋渔业标准化技术委员会归口。
本标准起草单位：山东省海洋水产研究所、山东省水产品质量检验中心。
本标准主要起草人：刘慧慧，张秀珍，徐英江，田秀慧，于召强，邓旭修。
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DB37/T2094—2012
水产品中羟脯氨酸含量的测定高效液相色谱法
1范围
本标准规定了水产品中羟脯氨酸的高效液相色谱测定方法。本标准适用于水产品中羟脯氨酸含量的测定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3原理
用盐酸于110℃水解试样，稀释、过滤水解产物，羟脯氨酸经DABS-Cl衍生后，用C18柱分离，高效液相色谱紫外检测器检测，外标法定量。
4试剂
4.1除另有规定外，所有试剂均为分析纯。4.2试剂主要包括：
——实验用水：应符合GB/T6682中一级水标准；——乙腈：色谱纯；
——盐酸；
——无水乙醇；
——N，N-二甲基甲酰胺；——碳酸氢钠；
——氢氧化钠；
——柠檬酸：优级纯；——磷酸二氢钠；
——二甲基氨基偶氮苯磺酰氯：DABS-Cl（4-Dimethylaminoazobenzene-4-sulfonylchloride），纯度≥98﹪;
——羟脯氨酸标准品：L-羟脯氨酸（L-Hyp），纯度≥99﹪;
——羟脯氨酸标准储备溶液：准确称取羟脯氨酸标准品0.1000g，用水溶解并定容至100mL。此溶液浓度为1.00g/L。4℃避光保存，有效期1个月；
——羟脯氨酸标准中间溶液：移取羟脯氨酸标准储备溶液，用水逐级稀释至1.0mg/L。临用时配制；
——0.1mol/L碳酸氢钠溶液：称取碳酸氢钠8.4g，用水溶解并稀释至1L；——2mol/L氢氧化钠溶液：称取氢氧化钠80g，用水溶解并稀释至1L；
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DB37/T2094—2012
——0.1mol/L柠檬酸溶液：称取柠檬酸21.0g，用900mL水溶解，加2mol/L氢氧化钠溶液70mL，用2mol/L氢氧化钠溶液滴定至pH6.4，用水定容至1L；
——12mmol/L柠檬酸溶液：量取0.1mol/L柠檬酸溶液120mL，加N，N-二甲基甲酰胺40mL，用水稀释至1L；
——衍生试剂溶液：称取DABS-Cl0.013g，用乙腈溶解并定容至10mL，4℃避光保存，有效期1个月；
——衍生反应终止液：配制50mmol/L磷酸二氢钠溶液，用2mol/L氢氧化钠溶液调至pH7.0，再加等体积无水乙醇；
——6mol/L盐酸溶液：取盐酸50mL，加水稀释并定容至100mL。
5仪器与设备
主要包括：
——高效液相色谱仪：配紫外检测器；——天平：感量0.01g；
——电子天平：感量0.0001g；——匀浆机；
——电热恒温干燥箱；——恒温水浴；
——真空泵；
——酒精喷灯；
——微孔滤膜：0.45μm；——涡旋混合器。
6试样制备
鱼，去鳞、去皮，沿脊背取肌肉，将肌肉、鳞、皮单独收集；虾，去头、去壳、去肠线，取肌肉部分；蟹、贝、甲鱼、海参、海带等取可食部分，样品充分搅碎、混匀。如不能及时检测，-18℃以下冷冻保存备用。
7测定步骤
7.1水解
称取适量匀浆后的样品于水解管中，使每管中含蛋白质约20mg，加入6mol/L盐酸6mL，充氮气1min，抽真空至管内盐酸起泡，用火焰将管封口。于110℃水解22h，冷却后，将水解液全部转移到50mL容量瓶中，加水至刻度。混匀后，根据样品中羟脯氨酸含量不同，分别取1mL～5mL水解液于10mL容量瓶中，加2mol/L氢氧化钠溶液调节pH至6.5～7.5，加水稀