乳制品羟脯氨酸含量测定方法.doc

乳制品中L－羟脯氨酸含量的测定方法 1 范围 本方法为中L-羟脯氨酸的测定方法。 本方法适用于中L-羟脯氨酸的测定。 引用标准 GB 9695.23-2008 肉与肉制品 羟脯氨酸含量测定2 术语与定义 中L-羟脯氨酸含量 hydroxyproline content of foods 在本方法规定的条件下测定的L-羟脯氨酸的含量。 L-羟脯氨酸含量用质量分数表示。 原理 用硫酸于105℃水解试样，释放出L-羟脯氨酸。L-羟脯氨酸经氯胺T氧化后，与对二甲胺基苯甲醛反应生成红色化合物，在波长558nm处进行比色测定。 L-羟脯氨酸存在于动物胶、骨胶原或动物的结缔组织中。水解动物蛋白(HAP)（Hydrolyzed?animal?protein?，中文别名：酶解胶原蛋白）中L-羟脯氨酸含量约为10%，对于乳与乳制品本身组成成分中不存在L-羟脯氨酸，但产品标准中有氮、蛋白质或氨基酸含量的规定的乳与乳制品，可通过本方法检测L-羟脯氨酸的含量并推算出动物水解蛋白的大体含量，样品是否添加动物水解蛋白，以及动物水解蛋白的大体含量。 通过 4 试剂 如无特别说明，所用试剂均为分析纯。水为蒸馏水或去离子水，或相同纯度的水。 4.1 硫酸溶液[c(H2SO4)≈3mol/L] 量取750mL水于2L的中，在搅拌下缓慢加入320mL浓硫酸（ρ20=1.84g/mL）。冷却到室温后2L容量瓶中，用水定容。 4.2 缓冲溶液（pH=6.8） 包括下列组分： 26.0g一水柠檬酸（C6H8O7.H2O）； 14.0g氢氧化钠； 78.0g无水乙酸钠[Na(CH3CO2)]。 用500mL水溶解上述试剂并转入1L的容量瓶中，加入250mL正丙醇，用水定容。 该溶液于4℃暗处稳定保存几周。 4.3 氯胺T溶液 称取1.41g三水·N-氯-对甲苯磺酰胺钠盐（氯胺T），用100mL缓冲溶液（4.2）溶解。 临用时配制。 4.4 显色剂 称取10.0g对二甲胺基苯甲醛，用35mL高氯酸溶液[60%(质量分数)]溶解，缓慢加入65mL异丙醇。临用前配制。 若对二甲胺基苯甲醛需纯化（见8.4注），可按如下操作：用70%（体积分数）热乙醇配制对二甲胺基苯甲醛饱和溶液。依次在室温和冰箱中冷却，12h后，用布氏漏斗过滤。用少量70%（体积分数）乙醇洗涤布氏漏斗中的固体。将固体转移至三角瓶中，用70%（体积分数）热乙醇重新溶解固体，加入冷水充分搅拌，至有大量乳白色晶体析出，于冰箱中过夜。用布氏漏斗过滤固体，用50%（体积分数）乙醇洗涤后，在有五氧化二磷干燥剂的条件下进行真空干燥。 4.5 L-羟脯氨酸标准溶液 4.5.1 标准储备液 称取50mg L-羟脯氨酸于100mL容量瓶中，用水溶解，加一滴硫酸溶液（4.1），用水定容。该溶液于4℃下可稳定存放1个月。 4.5.2 标准工作液 移取5.00mL上述标准储备液至500mL容量瓶中，用水定容。分别吸取该溶液10.00mL、20.00mL、30.00mL、40.00mL于100mL容量瓶中，用水定容，所得标准工作液浓度依次为0.5μg/ mL、1.0μg/ mL、1.5μg/ mL、2.0μg/ mL。临用前配制。 仪器和设备及材料 实验室常规仪器及下列仪器、材料。 5.1分析天平：感量0.0001g。 5.2三角瓶：容量为100 mL，长颈，小口。 5.3表面皿：直径为5cm～6cm。 5.4干燥箱：可控温于105℃±1℃。 5.5圆形滤纸：直径为12.5cm。 5.6容量瓶：250 mL、100 mL。 5.7比色管：25 mL。 5.8铝箔或不透明塑料薄膜。 5.9水浴锅：可控温于60℃±1℃。 5.10分光光度计：可用波长558nm±2 nm；或使用光电比色计，其中干涉滤波器最大吸收波长为558nm±2 nm。 5.11比色皿：光程为1cm。 分析步骤 试样制备 贮藏在冰箱中液体食品，在实验前取出并达室温。 液态试样 准确称取试样10g，精确至0.0001g，置于100 mL三角瓶中（5.2），避免试样粘在三角瓶壁上。 固态试样 准确称取均匀试样2～5g，精确至0.0001g，置于100 mL三角瓶中（5.2），避免试样粘在三角瓶壁上。（若加入硫酸溶液（4.1）后糊底，不能摇匀，如乳粉等试样，可准确称取均匀试样15g，精确至0.0001g，置于烧杯中，加入水搅拌均匀，并定容于100mL容量瓶中。准确吸取10mL于100 mL三角瓶中，避免试样粘在三角瓶壁上。） 水解 6.2.1 量取30mL±1 mL硫酸溶液（4.1），加入三角瓶中，用表面皿盖住，于105℃干燥箱内恒温16h。 6.2.2 用圆形滤纸趁热将水解产物过滤至250mL容量瓶中，