IER5原核表达载体的构建及融合蛋白表达、纯化的开题报告.pdf

IER5原核表达载体的构建及融合蛋白表达、纯化的

开题报告

一、选取载体

根据研究需求以及现有实验室资源，我选择了pET-28a(+)作为IER5

原核表达载体。

pET-28a(+)是一种广泛使用的原核表达载体，其中包含T7启动子、

His-Tag序列等功能区域，可以快速、高效地表达目标蛋白，并通过His-

Tag序列方便地进行纯化。

二、构建IER5表达载体

1.模板DNA提取

采取血细胞培养液中提取RNA的方法，利用RNA的反转录酶AMV

进行反转录，将反转录产物提取出来测序鉴定，验证序列准确性。

2.IER5基因克隆

根据IER5cDNA序列设计引物，进行PCR扩增，将PCR产物与

pET-28a(+)进行连接，构建目标表达载体。

3.转化宿主细胞

将构建好的IER5表达载体通过化学转化法或电转化法导入宿主菌，

例如大肠杆菌BL21(DE3)等。

三、融合蛋白表达与纯化

1.转化后的细胞培养

将BL21(DE3)细胞在复杂培养基中培养，过量表达IER5-6xHis融合

蛋白。

2.蛋白分离

在原加工物中添加有~100mM的催化剂并加入至少15％SDS聚丙

烯酰胺凝胶中，进行SDS，然后将含有目标蛋白的凝胶切割。

3.His-Tag亲和层析纯化

将切割出来的蛋白在His-Tag树脂上进行纯化。

四、预期结果

成功构建IER5原核表达载体并将其导入宿主菌中，通过过量表达的

方式得到IER5-6xHis融合蛋白，并通过His-Tag亲和层析纯化得到高纯

度的蛋白样品。这将为后续的研究提供坚实的基础。