第四章-2 基因工程课件.ppt

基因工程;目的基因的克隆与基因文库的构建;目的基因的克隆与基因文库的构建;;A鸟枪法;鸟枪法克隆目的基因的基本战略;鸟枪法克隆目的基因的基本战略;特点;鸟枪法操作的改进;鸟枪法操作的改进;鸟枪法操作的改进;鸟枪法克隆目的基因的局限性;B基因文库的构建;基因组文库的构建

基因文库（genelibrary）：用重组DNA技术将某种生物细胞的总DNA或染色体DNA的所有片段随机地连接在载体上，然后转移到适当的宿主细胞中通过细胞增殖而构成各个片段的克隆。当制备的克隆数目多到可以把某种生物的全部基因都包含在内的情况下，这一组克隆的总体就称为某种生物的基因文库。同一定义也适用于线粒体或叶绿体ＤＮＡ的基因文库。由于制备ＤＮＡ片段的切点是随机的，所以每一克隆内所含的ＤＮＡ片段即可能是一个或几个基因，也可能是一个基因的一部分或除完整基因外还包含着两侧的邻近ＤＮＡ顺序。

;基因文库的构建就是利用所谓的“鸟抢法”，使基因组的DNA片段随机地插入适当的载体中，引入细胞进行大量繁殖而构建的。;基因文库的基本概念;基因文库的基本概念;基因组DNA文库;构建基因文库的基因组DNA必须进行纯化后，才能用来制备适用于载体插入片断大小的随机片断;基因文库的构建程序;基因文库的构建程序;用于构建基因文库片段的产生大致有两种方法：

一、限制性内切酶完全消化基因组DNA

这个方法有两个特点：

1、假如所需的基因含有所用限制酶的识别位点，那么这一基因将被克隆在两个或数个片段中，给研究带来一定的困难。

2、一般常用的限制酶大多识别六个bp序列，切割DNA所产生的片段的平均大小相对比较小（约4kb即46＝4096bp），因此整个基因文库要含有非常大量的重组体，这样应用分子杂交法进行筛选就十分费事费时。虽然可以用限制酶进行部分消化，产生约20kb的片段，但这种方法必须掌握好酶解的条件。

;;二、机械随机切割

这种方法可以制备大片段的DNA（用噬菌体λ作载体约20kb，以cosmid作载体约45kb），从而克服上述的两处缺点。但是这种方法的不是之处是：所制备的片段的末端顺序是随机的，还必须经???末端修复，人工制造接头等手续才能与载体ＤＮＡ进行连接。

用于基因文库构建的载体常用噬菌体λ或cosmid载体，因为它们的容量比较大，可克隆大片段的DNA。虽然cosmid载体比λ载体的容量大，但由于文库的保存（cosmid载体在E.coli中，λ载体在噬菌体中）λ比cosmid容易，因此λ载体用的更多些。;基因文库的基本概念;基因文库的构建程序;基因文库的构建程序;基因文库的构建程序;video;CcDNA法;cDNA基因克隆

cDNA文库是指得到足够多的分别克隆的cDNA片段，汇集这些克隆应包含某种细胞中各种mRNA的相应顺序，每种顺序至少有一份拷贝，这种克隆片段的汇集体称为某种细胞的cDNA文库。

;;cDNA文库;cDNA文库对于真核生物的基因分析

cDNA文库是只含有编码蛋白的基因文库

cDNAs没有内含子?基因可以在E.coli中直接表达

用于新基因的鉴别

组织或特殊类型细胞（基因的特异表达）;cDNA文库-mRNA分离;1.传统的分离方法是用oligo(dT)-纤维素柱

分离总RNA;用纤维素纯化poly(A)mRNA的流程图;确定mRNA没被降解

方法:

mRNA的翻译:用体外蛋白质合成检测mRNAs。（麦胚无细胞转译体系或兔网织细胞裂解物转译体系）

通过凝胶电泳分析mRNAs:用琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳;克隆特殊的mRNAs;cDNA的合成:;cDNA法克隆目的基因的基本战略;cDNA第二链的合成;cDNA第二链的合成;cDNA第二链的合成;cDNA法克隆目的基因的基本战略;cDNA法分离目的基因的基本程序;cDNA法分离目的基因的基本程序;cDNA法分离目的基因的基本程序;差异分离程序;cDNA克隆的优越性

1.以mRNA为材料；

（一些RNA病毒，不经过DNA中间体，对其研

究，cDNA是唯一可行的方法）

2.基因文库的筛选比较简单易行；

3.由于每一个cDNA克隆都含有一种mRNA序列，

在选择中出现假阳性的几率比较低；

4.克隆在细菌中表达的基因，用作基因序列的测定，

和发育过程中或组织中基因特异表达

;cDNA法克隆目的基因的局限性;DPCR法;;由TaqDNA聚合酶扩增的PCR产物中，其3’末