第四章 基因工程药物设计与研制方法2012_PPT幻灯片.pptx
第四章基因工程药物设计与研制方法
一节重组蛋白药物的复制
·重组蛋白药物开发约需10亿美元。
·预测全球生物仿制药市场在2014年可高达一百
九十四亿美元。
·现有的生物制剂专利很大一部分即将过期，到2016年，约有250亿美金份额的生物制剂将失去专利保护。
·新的生物药不断获得批准，预测2010年批准的新药中将有1/3是生物药。
表达系统的选择和建立
稳定细胞系的建立蛋白的高效表达药物蛋白的纯化
体内和体外的检测方法的建立
表达细胞的工业化培养
药物蛋白大规模纯化技术质量控制
临床试验
市场开发
一、复制生物技术药品的一般技术流程
组织目的基因的克隆细胞
实验室阶段工业化阶段
·蛋白质的高级结构难以复制。
·药效和安全性难以与原药品一致。
·开发周期较长，注册仍需要临床试验。
(二)复制蛋白药物的主要问题一一免疫原性
·蛋白药物免疫原性还包括：分子多聚体、污染物、分解片段等。
·免疫原性与患者、治疗流程、制备工艺有关。
二、复制重组蛋白药品存在的问题
(三产生说伴的后果
·多数情况无临床后果。
·有时可能提高药效。
·少数免疫原性太强，导致药品无法使用。
·抗体还可能与内源因子反应，导致药品
禁止使用。
(四)预测蛋白药物的免疫原性的方法
·现有的抗原决定簇公式难以预测免疫原性。
·抗血清筛选不能完全说明该抗体就是由药物
蛋白激发。
·同一种蛋白的转基因小鼠可以较好预测药物
蛋白的免疫原性。
第二节通过对现有药物的优化和改造研发新药
一、定向突变
采用随机的基因突变或基因重组技术与定向的突变体筛选方法相结合的分子进化技术。
·自然界进化：先突变后选择。
·基因工程加速了进化历程。
·基因工程一般预先知道突变结果。
·根据已有基因的序列和功能进行设计，称为理性设计。
·定向突变模拟自然进化方法，首选让基因发生随机突变，通过筛选系统进行定向筛选或选择。
预先不知道基因或蛋白质序列，称为非理性设计。
定向进化技术的三个步骤
·制备突变体文库。
·突变体文库在适当的表达系统内表达。
·筛选突变体。
(一)易错PCR
·易错PCR的概念
是在采用DNA聚合酶进行目的基因扩增时，通过
调整反应条件来改变扩增过程中的突变频率，从而以一定的频率向目的基因中随机引入突变，获得蛋白质分子的随机突变体。
·增加碱基错配的方法
·提高镁离子浓度。
·加入锰离子。
·改变体系中的dNTPs浓度。
·运用低保真度DNA聚合酶等。
·易错PCR成功的关键
选择合适的突变频率。
一般目的基因突变1.5-5个时，诱变结果理想。
·嵌套易错PCR,使其PCR错误积累。
(二)DNA或基因改组(DNAshufling)
以单个基因或多个同源基因为模板，将其切割成一系列随机大小的DNA小片段，然后在体外通过聚合酶链式反应将这些片段随机重组成全长基因，实现同源基因重组，达到分子进化目的的一种技术。
DNA或基因改组也称分子育种或有性PCR
crossovers
RepeatedCyelesofPrimerlessPCR
·Dnase或超声波将模板产生DNA片段；·随机片段变性；
·随机片段复性；
·延伸；
·反复重复2-4步后，可获得全长DNA片段。
DNAShuftling的基本步骤
Parental
Random
Sequences
Fragmentation
FinalLibrary
01010T
DenaturizationAnnealingExtension
》
m
T
重组基因重新作为模板，重复多个循环，直至筛选出所需的突变基因
图1DNA改组步骤示意图
DNaseI酶切或超声破碎
又
通过PCR法将基因片段随机重聚为全长基因
又
实例：随机挑取枯草杆菌蛋白酶DNA重组装库中10个克隆序列。
Familyofrelated
DNAsequences
Fragment
Poolofrandom
DNAfragments
DNAshuflingMethodology
飞
Selectpositive
combinationsofmutations
Removenegative
combinationsofmutations
Largeibraryofrecombinants
Soloctorscroen
Reassemble
DNAShufiling的基本原理
·DNAShuffling