.第四章-基因工程的操作过程.ppt
文本预览下载声明
生物工程专业核心课程 基因工程的基本概念 A DNA的体外重组(切与接) B 重组DNA分子的转化和扩增(转与增) C 转化子的筛选和鉴定(检) C 转化子的筛选和鉴定(检) 转化细胞的扩增 扩增操作的目的 增殖转化细胞,使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序 扩增和表达载体分子上的标记基因,便于筛选 表达外源基因,便于筛选和鉴定 4 基因工程的操作过程 载体遗传标记检测 克隆DNA序列检测 外源基因产物检测 4 基因工程的操作过程 由于重组率和转化率不可能达到理想极限,因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子 转化子 重组子 目的重组子 载体遗传标记检测 抗药性筛选法 ROP ROI Sal I BamH I Tc r Pvu I Pst I Pst I EcoR I Cla I Hind III Hind II Bal I Ap r 抗药性筛选法的基本原理: pBR322 4363 bp ori 抗药性筛选法可区分转化子与非 转化子、重组子与非重组子 将外源DNA片段插在EcoRI位点: 非重组子呈 Apr、Tcr 重组子呈 Apr、Tcr 将外源DNA片段插在BamHI位点: 非重组子呈 Apr、Tcr 重组子呈 Apr、Tcs 载体遗传标记检测 抗药性筛选法 抗药性筛选法的基本操作: 先将转化液涂布含有Ap的平板 再将Ap平板上的转化子影印至 含有Ap和Tc的平板上 在Ap平板上生长、但在Ap和Tc 平板上不长的转化子即为 Ap Ap + Tc 影印 挑选 重组子 载体遗传标记检测 营养缺陷型筛选法 营养缺陷型筛选法的基本原理: 营养缺陷型筛选法可以区分转化子与非转化子,一般不能区分重组子与非重组子。其原理是:载体分子上携带某种营养组份的合成基因,而受体细胞本身不能合成这一营养组份,将转化细胞涂布在不含此营养组份的培养基上,长出的便是转化子 载体遗传标记检测 营养缺陷型筛选法 常见的营养缺陷型筛选标记: 哺乳动物细胞中存在两条dTTP的合成途径: 用于大肠杆菌的营养标记基因常选用色氨酸生物合成基因trp+ 用于高等哺乳动物细胞的营养标记基因常使用胸腺嘧啶核苷激 酶基因tk,相应的受体细胞则选择tk-缺陷型 dCDP dTDP dTTP TR dTMP dTDP dTTP AP TK AP 氨基喋呤 TK 胸腺嘧啶核苷激酶 载体遗传标记检测 显色筛选法 显色筛选法的基本原理: 显色筛选法可以区分转化子与非转化子,也可区分重组子与非重组子。其原理是:载体分子上携带某种显色酶基因,其表达产物能使细胞产生颜色反应,从而易于辨认和挑选,如大肠杆菌质粒pUC18携带的lacZ’基因(蓝色反应)、链霉菌质粒pIJ702携带的melC基因(黑色反应)等 载体遗传标记检测 显色筛选法 显色筛选法的基本操作: pUC18 Ap r lacZ ori Ap + X-gal 重组子(Apr + lacZ-) 将外源基因克隆在pUC18的lacZ’标记基因内部,使之灭活,此时重组子呈Apr、lacZ-,淡黄色菌落;而非重组子则呈Apr、lacZ+,蓝色菌落 克隆DNA序列检测 限制性酶切图谱法 所谓的限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外源DNA片段进行酶切图谱分析,并以此与目的基因的已知图谱对比,因此利用这种方法不仅能区分重组子与非重组子,而且还能鉴定目的重组子。但这种方法在用于数千规模的转化子筛选时,工作量极大,实验成本也高。 克隆DNA序列检测 限制性酶切图谱法 全酶解图谱法: pUC18 2.7 kb HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI Apr lacZ’ ori B B E P 4.0 kb 1.0 kb 0.8 kb 区分重组子与非重组子 用BamHI酶切转化子质粒DNA 电泳观察酶解产物片段 重组子: 2.7 kb + 4.0 kb 非重组子: 2.7 kb 如果外源DNA片段也是2.7 kb,最好选用单一切口的酶将质粒线型化,然 后通过其长度来鉴定其是否为重组子 克隆DNA序列检测 限制性酶切图谱法 全酶解图谱法: pUC18 2.7 kb HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI Apr lacZ’ ori S S B P 4.0 kb 1.0 kb 0.8 kb 区分重组子与非重组子 如果外源DNA片段插在pUC18的SphI位点处,原则上也可用SphI酶解鉴定,但这样做很不经济,因为SphI非
显示全部