第四章基因工程的基本技术DNA序列分析.解读.ppt

Chapter Four基因工程的基础知识与基本技术 第三节 DNA序列分析 Sanger双脱氧链终止法 Maxam-Gilbert化学裂解法 测序的常用方法 Sanger双脱氧链终止法(chain-terminator method) 1977年Sanger充分利用DNA复制的生物学特性, 设计了一种通过DNA复制来识别4种碱基的方法, 进行DNA序列测定,即双脱氧链终止法 因Sanger法测定了碱基序列, 获得1980年诺贝尔化学奖 (注：1958年因用酶法测得人胰岛素的氨基酸排序而得诺奖) 1.Sanger双脱氧链终止法原理 基本原理： 聚丙烯酰胺凝胶电泳可以区分长度只差一个核苷酸的DNA分子； 利用DNA聚合酶不能够区分dNTP和ddNTP的特性，使ddNTP参入到寡核苷酸链的3’-末端。因为ddNTP 3’不是-OH，不能与下一个核苷酸聚合延伸，从而终止DNA链的增长。 2 具体操作： 测序时分成四个反应, 每个反应除上述成分外分别加入2,3-双脱氧的A, C, G, T核苷三磷酸（称为ddATP, ddCTP,ddGTP, ddTTP）, 然后进行聚合反应。在第一个反应中, ddATP会随机地代替dATP参加反应，一旦ddATP加入了新合成的DNA链，由于其第3位的-OH变成了-H, 所以不能继续延伸,于是第一个反应中所产生的DNA链都是到A就终止了。 制得的四组混合物全部平行地点加在变性聚丙烯酸受凝胶电泳板上进行电泳，每组制品中的各个组分将按其链长的不同得到分离，从而制得相应的放射性自显影图谱。从所得图谱即可直接读得DNA的碱基序列。  3、技术路线： 制备单链模板 ↓ 将单链模板与一小段引物退火 ↓ 加入DNA多聚酶4种脱氧核苷酸 分别加入少量4种双脱氧核苷酸 ↓ 将4种反应产物分别在4条泳道电泳 ↓ 根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列 4.双脱氧终止法测序反应体系： DNA聚合酶 单链DNA模板 带有3’-OH末端的单链寡核苷酸引物 Mg2+ 4种dNTP(dATP,dGTP,dCTP和dTTP) 4种ddNTP(ddATP,ddGTP,ddCTP和ddTTP) Sanger法DNA测序的试剂 ① 引物：通常由20-23个碱基构成，G+C=12，A+T=8到11，Tm=60-68℃，避免形成引物二聚体或形成发卡结构 ② 模板 ③ DNA聚合酶 ④ 2’,3’-双脱氧核苷三磷酸 （ 2’,3’-dideoxynucleoside triphosphate, ddNTP ） ⑤ dNTP 5.测序过程: (1) 模板纯化与引物合成 (2) DNA链的延长和合成阻断 四个试管分别加入 DNA聚合酶 dNTP 标记引物 终止剂不同 ddA ddG ddC ddT 四个试管中所有产物是一系列长度只差一个核苷酸的聚合链 (3) 电泳 ACGT次序 高压电泳 (4) 放射自显影得到直读图象 1.化学裂解法测序的原理 (1) 用放射性核素标记待测DNA一侧末端 (2) 将标记DNA分为G、A+G、C+T、C 4个反应体系 (3) 用不同的化学试剂处理不同反应体系，随机断裂DNA片段某种碱基中的任何一个，产生一组混合物 (4) 电泳分离，放射自显影得到图谱，即可读出DNA序列 三 全自动激光荧光DNA测序 DNA自动测序仪的应用实现了凝胶电泳、初始数据获取、碱基阅读等步骤自动化。 自动测序仪的设计原理是采用荧光标记DNA片段，并用激光激活的荧光探测系统，检测序列反应的分离产物，读出电泳条带所示的碱基顺序。 分离产物有两种基本方法： 单荧光标记四泳道分离和四荧光标记的单泳道分离。 四标记单泳道法： ABI公司（美国应用生物系统公司）发展的四标记单泳道法是用4种不同的荧光标记物标记4个反应的产物，4个反应在一个泳道中电泳分离。每个反应产物用不同颜色的荧光标记进行区分， 再用计算机将经过荧光探头的不同颜色顺序转变成测序信息。 这种同一泳道的分离避免了泳道间差异对测序的影响。 荧光标记物 聚合反应及产物 荧光化合物标记链终止法以荧光颜色为标记信号，每种ddNTP各有1种代表颜色；整个反应在一个试管中进行；当新合成的终止单链通过荧光监测仪时，可由光信号读出末端核苷酸并由电脑记录。 作业： 3 DNA测序有哪些方法 4 Sanger双脱氧链终止法原理 * * 1 2 1. 高负荷，1块胶可测16个样品； 2. 机读不需放射自显影； 3. 安全不用同位素； 4. 简单迅速8-10h 不需酶促反应，可