《分子克隆》课件.pptx

基因工程GeneticEn;基因工程课程内容5234;用于基因克隆的载体DNA的体外;质粒载体1噬菌体或病毒载体2人;重要的噬菌粒载体：pUC118;重要的噬菌粒载体：pBlues;人类、动物、植物的全基因组序列;酵母人工染色体（YeastA;酵母人工染色体的使用：pYAC;细菌人工染色体（Bacteri;优点：能携带大片段DNA，约3;2.1用于基因克隆的载体质;克隆载体DNA的体外重组（切与;基因工程的操作过程切接转增检;DNA的体外重组（切、接）T4;限制性核酸内切酶的功能与类型1;限制性核酸内切酶的类型主要特性;2、II型限制性核酸内切酶识别;II型“限切酶”的识别与切割;II型“限制性核酸内切酶”的命;II型限制性核酸内切酶的命名E;大肠杆菌中的dam甲基化酶在5;II型“限切酶”的切割产物5;EcoRI等产生的5‘粘性末端;PstI等产生的3‘粘性末端5;PvuII等产生的平头末端5‘;同裂酶与同尾酶同裂酶：识别位点;6、“限切酶”酶活性定义Tri;限切酶的“星活性”（Star;DNA的体外重组（切、接）其他;二、T4DNA连接酶DNA连;B.修复RNA-DNA杂合分;DNA连接酶的基本性质C.连;DNA连接酶的活性单位定义Tr;限制性核酸内切酶T4DNA链接;1.DNA聚合酶1）大肠杆菌D;待切除的核酸分子必须具有5‘端;缺口前移标记法大肠杆菌DNA聚;缺口前移标记原理;2）大肠杆菌DNA聚合酶I;补平由核酸内切酶产生的5‘粘性;Klenow酶的基本用途之一：;Klenow酶的基本用途之二：;03在四种dNTP均存在时，聚;T4-DNA聚合酶用途之一：T;T4-DNA聚合酶用途之二：;4）依赖于RNA的DNA聚合酶;反转录酶的基本用途之二：;2、核酸酶1）单链核酸外切酶：;2）双链核酸外切酶：核酸外切酶;3）双链核酸外切酶：l核酸外;4）单链核酸内切酶：S1核酸酶;单链核酸内切酶：S1核酸酶S1;S1核酸酶的基本用途：内切带缺;S1核酸酶的重要用途：在DNA;5）单链内切双链外切的核酸酶：;单链内切双链外切的核酸酶：Ba;3、核酸修饰酶1）末端脱氧核苷;TdT的基本特性：5‘p3‘;来自小牛胸腺的碱性磷酸单酯酶（;可以有效防止载体自身环化;3）T4-多核苷酸磷酸激酶（T;DNA的体外重组（切、接）T4;四、DNA体外重组操作提高重组;1、DNA酶切组合策略与操作尽;低盐酶：0-50mM01;多酶联合酶解时的策略A、对盐浓;B、对盐浓度要求??同的酶，可采;DNA样品纯度要求与操作待酶切;在基因文库构建中具有重要意义D;2、DNA连接策略与操作一粘一;1）单酶切粘性末端的连接：载体;TGATCA2）同尾酶生产的粘;从分子动力学的角度讲，由限制性;GACGTC4）不同粘性末端的;GATCC5）不同粘性末端的连;3ACGTC5）不同粘性末;CAAAAAAAAAA3;GGATCC6）粘性末端的更换;重组率的定义重组率=含有外;提高重组率的策略1）提高外源D;CGTACGGGGGGACGT