《分子克隆指南》（上）.pdf
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余功臣(分子克隆)余功臣(分子克隆).doc
分子克隆技术实验报告
应用生物技术0801
2008304201308
余功臣
2011年5月22日
说明
实验是由小组成员集体完成，实验报告以及结果分析由个人完成。小组成员：余功臣、晏星、何一鸣、伍良伟。试验时间由2011年5月8日至5月14日，共完成分子克隆、分子杂交和基因表达检测三大部分的实验。下列实验报告中的实验试剂具体成分以及配置方式均未列出，详见《分子克隆技术实验手册》附录。
一．将M812载体上的水稻DNA片段亚克隆于pUC19载体上
摘要
运用碱裂解法抽提质粒载体pUC19和带有水稻目的DNA片
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2分子克隆幻灯片.ppt
第二章 DNA克隆技术 本章，我们讨论4个问题： 1. 什么是DNA克隆技术——DNA克隆技术的概念。 2. 为什么能进行DNA克隆技术——DNA克隆技术的原理和技术路线。 3.怎样进行DNA克隆技术——DNA克隆技术的步骤（DNA体外重组，重组DNA导入宿主细胞后扩增和表达，基因工程后处理） 4. DNA克隆技术的应用和前景——对于医学来说即生产基因工程产品、开展基因治疗等。 DNA克隆/ 基因克隆/ 分子克隆 将重组的DNA通过一定方式导入宿主细胞内，并且在宿主细胞中进行复制扩增，形成大量与亲代分子完全相同的子代DNA分子的过程。 克隆的含义 DNA克隆：
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分子克隆流程手册.pdf
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分子克隆常用的工具酶.ppt
核酸酶BAL31從線形DNA分子兩端（粘端/平端）以漸進方式切去單核苷酸，以形成寡聚核苷酸或製造末端缺失。此外也有類似於SI酶單鏈特異降解活性，可除去粘性末端或單鏈髮夾結構。外切核酸酶Ⅲ能從線性DNA的3′-OH末端沿3′→5′方向切去單核苷酸，製造3′端缺失，製備DNA範本或特異DNA探針。T4多聚核苷酸激酶能將ATP上的γ位磷酸轉移到單鏈或雙鏈DNA或RNA的5′-OH上，可將γ-32P-ATP中的32P連接到5′端的5′-OH上，以完成寡聚核苷酸的核素標記。????分子克隆常用的工具酶
第一節???????限制性核酸內切酶與DNA分子的體外切割第二節???????DNA連接酶和DNA分子
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分子克隆常用的载体.ppt
第三節???????真核細胞的克隆載體一、在酵母細胞中克隆基因常用的載體（共同特點）1.整合型載體（YIP）2.複製型載體（YRP）3.附加體型載體（YEP）二、植物基因克隆的載體——Ti質粒三、動物細胞基因克隆的載體整合型載體（YIP）YIP型載體是由大腸桿菌質粒和酵母的DNA片段構成的。如Pyeleu10是由ColEI質粒和酵母DNA提供的亮氨酸基因（Leu2+）片段構成，在細菌中複製、擴增，進入酵母後可整合表達。YIP型載體的特點是轉化率低(只有1-10轉化子/微克DNA)，但轉化子遺傳性穩定穩定，多用於遺傳分析工作。複製型載體（YRP）YRP型載體是帶有選擇標記和複製子的酵母的DNA片
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《多酶切与分子克隆》课件.ppt
多酶切与分子克隆技术
课程学习目标介绍掌握基本概念理解多酶切和分子克隆的基本原理、核心概念和关键技术。精通实验操作熟练掌握多酶切和分子克隆的实验流程，并能独立进行实验操作。拓展应用领域
什么是多酶切
多酶切的基本原理
限制性内切酶的概念
常用限制性内切酶种类
限制性内切酶识别位点
DNA片段的切割机制
多酶切实验的基本步骤
酶切反应体系配置
限制性内切酶的选择
酶切反应条件优化
分子克隆技术简介
分子克隆的基本流程
载体的选择与设计
常用克隆载体类型
质粒载体的结构特征
目的基因的筛选
基因克隆策略
限制性内切酶连接
DNA连接酶的作用
连接反应体系配置
连接反应条件控制
感受态细胞的制备
化
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分子克隆流程手册.pdf
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分子克隆实验.pdf
pUC191.5kbDNApUC1301
pUC19 pUC1301
BamHI+KpnI pUC 1301 1.5kb
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分子克隆常规操作B.doc
分子生物学实验常规技术操作
目 录
1. 质粒提取
1.1 小提质粒
1.2 小量快提质粒鉴定：
1.3 大提质粒：
2. 酶切
2.1 制备型酶切
2.2 小量酶切鉴定
2.3 DNA片段5突出端的补平
3. 琼脂糖凝胶电泳
4. 回收
4.1 从低熔点琼脂糖凝胶中回收DNA片段
4.2 小量胶回收DNA片段试剂盒操作（见操作手册）
4.3 无水乙醇沉淀回收
5. 连接
5.1 一般连接
5.2 平端动态连接
6. 转化
6.1 质粒快速转化
6.2 连接物转化
7. 制普通固体培养板
8. 涂板
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(精)分子克隆技术.ppt
分子克隆技术 * * 分子克隆（molecular cloning） 又称为基因克隆、基因工程、DNA克隆、重组DNA技术 克隆（Clone） 指通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体。 分子克隆 指按照人的意愿，在体外将某种生物的DNA片断插入到载体（质粒、病毒等）中，形成遗传物质的新组合---重组DNA分子（重组子），然后将重组子转移到宿主细胞中进行复制或表达，即对DNA分子进行克隆，以获得该DNA分子的大量拷贝。 基本原理： 将编码某一多肽或蛋白质的基因（外源基因）组装到细菌质粒（质粒是细菌染色体外的双链环状DNA分子）中，再将重组质粒转入大肠杆菌，这样
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第五讲 分子克隆载体.ppt
基因操作的基本步骤 载 体 单独一个包括启动子、编码区和终止子的基因，或者组成基因的某个元件，一般是不易进入受体细胞的，即使采用理化方法进入细胞后，也不容易在受体细胞内维持。 载体(vector): 能携带外源基因（或DNA片段）进入细胞复制、整合或表达的工具。 作为克隆载体的DNA分子具备的条件： 1 具有对受体细胞的可转移性，能携带外源基因进入宿主细胞； 2 能在宿主细胞中自主复制，并实现外源基因的增殖； 3 具有由单一限制酶识别位点组成的多克隆位点(MCS）； 4 克隆载体必须具有用于选择克隆子的标记基因； 5 克隆载体必须是安全的，
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3 第三讲1 分子克隆载体.ppt
;目的基因;基因操作的基本步骤;载 体;;;;;; ;;;;质粒的基本性质： 1 复制;;;3 质粒的转移性;构建质粒载体的基本原则;构建质粒载体的基本原则;构建质粒载体的基本原则;构建质粒载体的基本原则;构建质粒载体的基本原则;构建质粒克隆载体的基本策略;;质粒的命名;; pBR322的大小是4361bp的环状双链DNA，其碱基序列已经全部清楚。是最早应用于基因工程的载体之一。
含有24种限制酶的单一识别位点，具有四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)。
将质粒pSF124中含ampr基因的DNA片段和质粒pSC101中含tetr基因的DNA片段同
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分子克隆工具酶.ppt
S1核酸酶的基本特性 Ca2+ 5‘ dNMPs 或 5‘ NMPs ssDNA or RNA Ca2+ Ca2+ 5、单链内切双链外切的核酸酶：Bal31核酸酶 Bal31核酸酶的基本用途：诱发DNA突变 EcoRI A B C EcoRI EcoRI B C A Bal31 B C A 环化 A C ① ?链 有反转录活性和 RNaseH活性。 RNaseH： ?链经过蛋白酶水解后产生的一条多肽。 以5’?3’或3’?5’方向特异地水解RNA-DNA杂交双链中的RNA链。 RNaseH RNA DNA RNA DNA （3）逆转录酶的用途 ② ?链 RNA-DNA杂交双链中5’
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《分子克隆》课件.pptx
基因工程GeneticEn;基因工程课程内容5234;用于基因克隆的载体DNA的体外;质粒载体1噬菌体或病毒载体2人;重要的噬菌粒载体：pUC118;重要的噬菌粒载体：pBlues;人类、动物、植物的全基因组序列;酵母人工染色体（YeastA;酵母人工染色体的使用：pYAC;细菌人工染色体（Bacteri;优点：能携带大片段DNA，约3;2.1用于基因克隆的载体质;克隆载体DNA的体外重组（切与;基因工程的操作过程切接转增检;DNA的体外重组（切、接）T4;限制性核酸内切酶的功能与类型1;限制性核酸内切酶的类型主要特性;2、II型限制性核酸内切酶识别;II型“限切酶”的识别与切割;II型“限制
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分子克隆工具酶.pptx
第2章
分子克隆工具酶
在基因工程的实际操作中，工具酶的使用是一项基本技术。01在体外对DNA进行分离纯化、连接重组或者修饰合成等，都会涉及一系列酶促反应。02用于基因工程的工具酶种类繁多(表2.1)、根据其功能可粗略分为限制酶、连接酶、聚合酶和修饰酶4类。03
表2.1常用工具酶与基因克隆技术工具酶类主要用途限制性核酸内切酶切割DNA分子形成片段DNA连接酶DNA片段的连接重组大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ切口平移法标记DNA探针T7DNA聚合酶DNA序列测定分析TaqDNA聚合酶PCR体外扩增技术多核苷酸激酶末端标记法制备探针S1核酸酶去除双链DNA的局部单链
主要教学内容2.1限制性核酸内切酶限