分子克隆常规操作B.doc

分子生物学实验常规技术操作 目 录 1. 质粒提取 1.1 小提质粒 1.2 小量快提质粒鉴定： 1.3 大提质粒： 2. 酶切 2.1 制备型酶切 2.2 小量酶切鉴定 2.3 DNA片段5突出端的补平 3. 琼脂糖凝胶电泳 4. 回收 4.1 从低熔点琼脂糖凝胶中回收DNA片段 4.2 小量胶回收DNA片段试剂盒操作（见操作手册） 4.3 无水乙醇沉淀回收 5. 连接 5.1 一般连接 5.2 平端动态连接 6. 转化 6.1 质粒快速转化 6.2 连接物转化 7. 制普通固体培养板 8. 涂板 9. 挑菌 10. 血清中病毒核酸的提取(蛋白酶K法) 哺乳动物细胞单克隆株分离 常用溶液、培养基配制 1. 质粒提取： 1.1 小提质粒： 本实验室在常规条件下采用碱裂解法小量提取质粒 (1)从平板上挑取单菌落或摇甘油菌(5～50uL)，接种于3mL LB液体培养基中（加有相应的抗生素），37℃振荡培养至OD600 2.0以上，但也无需过浓。 * 通常DH5а菌株摇12～14hr;JM101 7～8hr;ER2566 10～12hr * (2)取1.5mL菌液于1.5mLEppendorf管（可取未灭菌的新管）中，12000rpm离心15～30sec，弃上清。通常可取1.5mL菌液再离心一次，弃去上清后在纸上扣干。 * 不要忘记将用完的试管及管盖放入指定处以备回收处理 * (3)加入100uL溶液I，振荡使菌体沉淀充分悬浮。 * 务必悬浮完全 * (4)加入200uL溶液II，立即轻轻翻转几下，使菌体裂解。 * 可观察到原浑浊的菌悬液变清变粘 * (5)加入150uL溶液Ⅲ，立即上下颠倒充分混匀7～10次，不宜太剧烈。 * 可观察到白色絮状沉淀出现。* (6)12000rpm离心3-5分钟。 (8)在离心过程中可取未灭菌的新1.5mLEppendorf管，加入等体积(350～400uL即可)酚-氯仿（25:24）备用；取灭菌过的新1.5mLEppendorf管，加入等体积(350-400即可)的异丙醇备用。 * 加酚-氯仿-异戊醇时要小心，应吸位于下层的酚相，而不要带入上层 的Tris-cl保护液 * (9)离心完将上清迅速倒入已加好的酚-氯仿中, 充分混匀。 * 小心不要将白色沉淀物倒入酚-氯仿-异戊醇中 * (10)12000rpm离心3～5分钟。 (11)吸水相，加入已加好的异丙醇中,颠倒混匀几次。 * 小心不要吸入酚相，没把握时宁愿放弃一些水相 * (13)12000rpm离心3-5分钟。 (14)迅速弃上清，沉淀用适量70%乙醇洗一次，于纸上扣干。 * 小心不要将沉淀洗掉 * (15)置于恒温器上干燥(55℃)至无色透明或无乙醇气味，一般大约5min。 (16)加入30～40uL 1×TE或ddH2O缓冲液溶解沉淀，-20℃储存备用。 * 做完实验请及时收拾实验台 * 1.2 小量快提质粒鉴定：（目前较少采用） (1)取培养的菌液1mL，12000rpm 离心30s，收集菌体，在纸上扣干残留培养液。 (2)用50uL 无菌水充分悬浮菌体。 (3)每管加入50uL酚-氯仿-异戊醇（25：24：1）并充分混匀。 (4)12000rpm 离心10分钟。 (5)小心吸取5uL上清上样电泳。(对于插入片段足够大的重组子，其迁移率应低于未插入片段的对照质粒。) * 做完实验请及时收拾实验台 * 1.3 大提质粒： (1)从－20℃保存的甘油菌吸取50uL菌液，接种到3～4mL的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为1.6～1.8。 (2)取0.5mL菌液接种到200mL LB培养基中，37℃振荡培养至OD600为2.0以上，再加入氯霉素至170ug/mL，37℃继续振荡培养12～16hr。 (3)将摇好的菌液4000rpm离心15min。 (4)弃上清，敞开离心管口倒置，尽量让上清全部流尽。 (5)用预冷的40mL STE充分悬浮菌体沉淀。 (6)4℃，4000rpm离心10min。 (7)弃上清，敞开离心管口倒置，让上清全部流尽。 (8)用预冷的4mL溶液Ⅰ充分悬浮菌体沉淀。 (9)加入新鲜配制的溶液Ⅱ 8mL，上下颠倒几次，液体会变得澄清，置于4℃10min。 (10)加入预冷的溶液Ⅲ 6mL，上下颠倒混匀后，4℃中放置30min。 (11)4℃，12000rpm离