《分子生物学研究技术》克隆.pptx

;技术原理;重组示意图;;pENTR?/D-TOPO?Vector;pCR?8/GW/TOPO?Vector

vectorenablesefficientTOPO?-TAcloning.Thesevectorseasilyfacilitatemultipurposeuse:rapidrecombinationintoavarietyofGateway?Destinationvectors,convenientsequencing,robustselectioninE.coliwithspectinomycin

resistance,andeasyexicisionofinsertDNAwithflankingEcoRIsites;完成构建Gateway?表达克隆步骤：

创建入门克隆，通过PCR或传统的克隆方法将目的基因克隆进入门载体。

混合包含目的基因的入门克隆和合适的目的载体及Gateway?LRClonase?酶，产生表达克隆。（表达克隆用来在合适的宿主中进行蛋白的表达和分析。;进入gateway的各种路线;所需载体系统;2Entryvector入门载体

Entryclone（入门克隆）克隆DNA片段到入门载体或供载体

（donorvector）的产物。入门克隆包含两侧具有attL位点的

目的基因。可以用于随后的向目的载体的基因转移。

Entryvector(pENTR?)（入门载体）包含attP位点的Gateway?载体。通过使用定向TOPO?克隆或传统的限制性内切酶和连接酶的方法，克隆DNA片段.;Cloningofthegeneof

interestinthecorrectorientationforexpression

Maintenanceofreading

frameforproteinexpression

Kanamycin-resistancegeneforselectionofentryclones;构建好Gateway?入门克隆后，可以进入多个表达系统;技术优点