《分子生物学研究技术》第1章第1节工具酶.pptx

分子生物学研究技术;第一章

分子克隆的工具酶和载体;DNA重组技术中常用的工具酶;第一节工具酶

一、限制性核酸内切酶

1.限制－修饰系统的概念

LurvaHuman1952BertaniWeigle1953观察λ噬菌体

限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段。各种细菌都能合成一种或几种能够切割DNA双链的核酸内切酶，它们以此来限制外源DNA存在于自身细胞内，但合成这种酶的细胞自身的DNA不受影响，因为这种细胞还合成了一种修饰酶，对自身的DNA进行了修饰，限制性酶对修饰过的DNA不能起作用。这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。

;E.coliK;E.coliKE.coliBE.coliC;E.coliKE.coliBE.coliC;2.限制性内切酶，甲基化酶

实验结果说明K和B菌株中存在一种限制系统，可排除（分解）外来的DNA。

这种限制作用就是限制性内切酶作用的结果。

10-4的存活率（低），是由宿主修饰系统作用的结果。

修饰酶作用的结果，使外源DNA幸存下来。

修饰酶，如甲基化酶，

它能修饰限制酶作用位点的结构，而使其不能被限制酶切割。

甲基化碱基：AN6甲基-腺膘呤

C5‘甲基-胞嘧啶

;核酸酶(nucleases)是指所有可以水解核酸的酶。

按底物不同分为：

DNA酶（DNase）

RNA酶（RNase）

按作用部位不同分为：

5′末端外切酶

核酸外切酶

3′末端外切酶

核酸内切酶

限制性核酸内切酶：

有严格的序列依赖性，是基因工程中的重要工具酶。

;限制性核酸内切酶：;3.限制性核酸内切酶的类型及特性;限制性核酸内切酶的命名法

用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄主菌的物种名称，如E.coli用Eco表示，所以用斜体字。

用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌Rd菌株用d，即Hind。

如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制与修饰体，则以罗马数字表示，如HindⅠ,HindⅡ，HindⅢ等。;第二类(II型)限制性内切酶：;二型限制性内切酶酶位点的分析

回文结构

“人过大佛寺，寺佛大过人”

“仙客来，来客仙”

“雾锁山头山锁雾”

“天连水尾水连天”

5’TGTGTGAATTGTACCGTACAATTCACACA-3’;;4.限??性内切酶产生的末端及其连接

(一）粘性末端;粘性末端;粘性末端连接;19;（二）平头末端：;平头末端;粘性末端与平头末端;;; ①产生5’突出粘性末端（cohesiveend）:以EcoRI为例：

5’…G↓AATTC…3’→5’…GOHPTTAAC…3’

3’…CATAA↑G…5’EcoRI3…CTTAAPOHG…5‘

②产生3’突出的粘性末端：以PstⅠ为例：

5’…CTGCA↓G…3’→5’…CTGCAOHPG…3’

3’…G↑ACGTC…5’PstI3’…GPOHACGTC…5

③产生平末端（bluntend）:NruⅠ为例：

5’…TCG↓CGA…3’→5’…TCGOHPCGA…3’

3’…AGC↑GCT…5’NruI3’…AGCPOHGCT…5’

;（三）同裂酶(Isoschizomers)：

来源不同，但识别和切割位点相同的酶。

酶切DNA后，产生同样的切割，形成同样的末端。如：HpaII和MspI，其靶序列是CCGG

但对甲基化碱基的敏感性不同。如，HpaII敏感，而MspI中性。

（四）同尾酶（Isocaudamer）：

来源不同，识别的靶序列不同，但产生的粘性末端相同的酶。 如：BamHI 与BglII

G↓GATCC A↓GATCA

一些识别4核苷酸序列包含在6个之中。

如：MboI和Sau3AI5’…↓GATC…3’

BamHI 5’…G↓GATCC…3’

一对同尾酶切割产生的粘性端连接后的位点叫“杂种位点”(hybridsite)，不能再被原来任何一种酶所识别。

4、6碱基识别酶的切点在DNA链上随机分布的频率不同。;DNA被一种酶切、连接后，