《分子生物学研究技术》第2章噬菌体展示技术.pptx

1;2;表面展示技术

surfacedisplaytechnologies;4;5;6;;M13噬菌体颗粒;M13噬菌体;丝状噬菌体基因;;;13;14;15;多价展示

单价展示;Phagedisplaysystem(invitro);18;多价展示

单价展示;pVIII

2700copies/virion

multivalentdisplay

smallpeptides

N-terminaldisplay

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requirestransformation;;22;Dprotein

-405copies/virion

multivalentdisplay

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N C-terminaldisplay

nosecretion

packaginginfection;24;25;;;;;;;?

?;;34;Panning;36;?

?;?;39;40;41;42;;44;45;/cn/products/drug/phd.htm;47;AntibodyIgGstructure;49;50;51;52;★免疫组织与器官;淋巴细胞再循环;scFv=singlechainFragmentvariableFab=Fragmentantibodybinding.;Heavychains;;CompleteFabproduct;59;60;（3）AffinitySelectionofAntibody;SelectionofCatalyticActivities;（4）HowscFvantibodieslooks:

Isamethodofasearchfor anewtumormarkers;64;scFv抗体库构建和筛选;66;67;核糖体展示

(ribosomedisplay);69;70;;72;73;四、抗体的结构及其多样性;75;76;77;;;80;81;82;;小分子抗体包括Fab、Fv或ScFv、单域抗体及最小识别单位等几种。

小分子抗体有很多优点:

可以用细菌发酵生产，成本低;分子小，穿透力强;

不含Fc，没有Fc带来的效应;

在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出;易于与毒素或酶连接，便于直接获得免疫毒素或

酶标抗体等。;;Fv、ScFv的大小约为全分子的1/6。;单链抗体的构建在已知亲本DNA序列时可用完全人工合成法;

在具备亲本单抗可变区的cDNA克隆时，可用定点突变法在其两端造成适当的内切酶位点，与人工合成的连接肽编码序列连接，组装到表达载体中;

如果从杂交瘤细胞系构建单链抗体，可用PCR方法扩增可变区基因，再组装到适当的表达载体上。;单链抗体最常用的表达体系是大肠杆菌，有2种方式:

一是表达为包涵或非包涵体的不溶蛋白。产量高可达细菌蛋白总量的5%-20%，但需进行变性复性，使其形成正确的立体结构，恢复抗体活性;

二是分泌型表达，将细菌的信号肽序列与单链抗体的氨基端相连，单链抗体分子就可分泌到质周腔和细菌体外，进行折叠后成为有活性的分子。但产量不及前者，一般实验室培养条件下每升细菌的产量仅在数毫克左右。;即为VH，约为完整分子的1/12。它只由一???结构域构成，故称单域抗体。单域抗体尽管亲和力有所降低，但仍保持着原单抗的特异性。;约为完整分子的1/80-1/70大小，一般由一个CDR构成，它也保持着抗体的特异性。;;92;Hollinger等巧妙地将Ａ抗原抗体的轻链可变区基因(VLA)与抗Ｂ抗原抗体的重链可变区(VHB)通过短肽连接子连接;同样地,将VHA与VLB连接,将两组嵌合基因置于双顺反子的表达质粒中,构建成双链抗体的表达质粒,目前报道的表达质粒均为双顺反子。表达后,VLAVHB与VHAVLB交叉连结,形成双特异性抗体。;;5、抗体库技术;人淋巴细胞;97;1990年McCafferty等成功地建立了噬菌体表面展示系统，通过将抗溶菌酶单链抗体基因克隆于fd噬菌体基因3的下游，使ScFv以融合蛋白的形式展示于噬菌体表面，利用亲和层析，两轮富集达106倍。该技术的成功给抗体基因的筛选工作带来了革命性的变革。;B.噬菌体表面展示文库技术的要点:

从免疫或未被免疫的B细胞中PCR扩增抗体全套基因片段随机克隆入相应载体形成组合文库

将基因组合文库插入噬菌体编码膜蛋白的基因g3或g8的先导系列的紧靠下游

外源基因表达多肽以融合蛋白形式展示在外壳蛋白N端;用固相化抗原经“亲和结合一洗脱一扩增”数个循环直接方便、简捷、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗体噬菌体库。

筛选到的噬菌体再将基因g3或g8切除后，转入大肠杆菌，

使翻译