分子生物学技术.ppt

第八章 分子生物学操作技术; ;精品资料; 你怎么称呼老师？ 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你是否会认为老师的教学方法需要改进？ 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ 教师的教鞭 “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我笨，没有学问无颜见爹娘 ……” “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”; ; ; ; ; ; ;8.2.1 基因组DNA的提取和纯化;提取方法：;注意事项：; ; ;; ;8.2.2 RNA提取和纯化;; ; ; ;8.2.3 质粒DNA的分离、纯化 ; ; ; ;质粒DNA的分离; ; ;8.3 DNA测序技术; ; ; ; ; ;蛋白质与DNA的相互作用 ; ; ;8.4 PCR技术;8.4.1 PCR技术简史; ; ; ;8.4.2 PCR技术的基本原理; ; ; ; ;8.4.3 PCR的反应体系与反应条件;二、PCR引物设计 PCR反应成功扩增的一个关键条件在于引物的正确设计。引物设计的总原则就是提高扩增的效率和特异性。其效率和特异性取决于两个方面，一是引物与模板的特异结合，二是聚合酶对引物的有效延伸。 PCR反应中有两条引物，即5′引物和3′引物。设计引物时，通常以信息链为基准，5′引物与位于待扩增片段5′上游的一小段DNA序列相同，以信息链的互补链为模板，引导信息链的合成，3′引物与扩增片段3′端的一小段DNA序列互补，引导互补链的合成。PCR反应扩增的就是这一对引物之间的DNA片段（？）。;PCR引物设计原则 1、引物长度一般为15~30个核苷酸。引物过短会使PCR的特异性降低，过长会提高相应的退火温度，并使延伸温度超过TaqDNA聚合酶的最适温度74℃,亦会影响产物的生成，且合成引物的成本增加。 2、引物中的碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤，嘧啶的堆积现象。尤其是引物的3′端不应有连续3个G和C。否则会使 引物在模板的G+C富集序列区错误配对。引物中G+C的含量 在45~55%左右。设计引物时要考虑3′端和5′端 引物具有相似的Tm值。Tm=4（G+C）+2（A+T）。引物长度要确保解链温度不低于54°C。; ;6、引物3′端碱基是引发延伸的起点，因此一定要与模板DNA配对。引物3′端的最佳碱基选择是G和C。因为它们形成的碱基配对比较稳定。 7、引物的5′端可以修饰，如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素，荧光物质，地高辛标记，加入???它短序列包括起始密码子，终止密码子等。在PCR的起始反应中，引物5′端游离的碱基并不影响引导新生链DNA合成的能力。但在后续的扩增循环中，这些与初始模板不配对的序列被带到PCR产物的双链中去，所以如此引物参与的PCR产物，既含有目的扩增片段又含有两侧引入的核苷酸序列。 ; 三、模板制备 PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。当用RNA作模板时，首先要进行逆转录生成cDNA，然后再进行正常的PCR循环。大多数用途的PCR反应中，对DNA模板的要求并不严格。首先对纯度要求不严。大量的实验数据表明存在一定量的蛋白质，或SDS等对实验过程影响不大，所以只要没有交叉污染，模板DNA的制备可以不必像克隆、酶切、连接、标记等反应所用DNA制备那样严格。其次，模板用量很低，理论上102~104拷贝的模板是可满足各种要求的PCR反应。由于种种原因，准备的模板量要求达一定水平。一方面可减少由于实验操作和实验精确度方面等原因而引起的扩增失败，同时用作扩增的模板DNA量越多，由于交叉污染引起的反应失败的可能性小。; 四、PCR产物的积累规律;PCR产物的积累规律示意图;五、PCR反应条件的控制 （一）PCR反应的缓冲液： 10～50mmol/L Tris-HCl 缓冲液，72℃ 时pH7.2,调节反应体系的pH值，使Taq DNA聚合酶的作用环境维持偏碱性。缓冲液含50mmol/L的KCl可促进引物退火，大于此浓度将会抑制TaqDNA聚合酶的活性。加入适量二甲基亚砜或甲酰胺有利于破坏模板的二级结构。 ;(二)镁离子浓度：1.5mmol/L Taq DNA聚合酶活性需要Mg2+。Mg2+ 浓度过低，会显著降低酶活性。Mg2+浓度过高又使酶催化非特异性扩增增强。Mg2+浓度还会影响引物的退火、模板与PCR产物的解链温度，从而影响扩增片段的产率。 在PCR反应中，Mg2+的总量应比dNTPs的浓度高。 其原因是引物、模板、dNTP分子中的磷酸基因可与Mg2+结合而降低游离Mg2+浓度，从而影响Taq DNA聚合酶的活性。 常用1.5mmol/L 。; (三)底物浓度：20~200μmol/L dNTP溶液具有较强的酸性。使用时应用NaOH将pH值调至7.0~7.5，分装小管，于-20℃存放，过多冻融会使dNTP产生降解。