分子生物学检验技术-第七章 克隆基因表达及基因干扰.ppt

第七章 克隆基因表达及基因干扰 概念 克隆（clone）: 是指细胞通过无性繁殖以后所产生的与亲代细胞完全相同的子代群体。 分子克隆（molecular cloning ） : 指按照人的意愿，在体外将制备的DNA片段与载体DNA重组（将不同来源的DNA分子通过磷酸二酯键连接成重组DNA分子），然后导入受体细胞，并在受体细胞中复制、扩增，以获得该DNA分子的大量拷贝的技术。 又叫重组DNA技术（DNA recombination）。 基因工程（gene engineering ）： 将基因进行克隆，并利用克隆的基因表达，制备特定的蛋白质或多肽产物，或定向改造细胞和生物个体的遗传性状所用的方法及相关的工作。 基因工程实际上包括两部分技术：分子克隆和基因表达，前者是上游技术，后者是下游技术。 基因工程示意图 第一节 工具酶Tool Enzyme 工具酶 在分子克隆技术中，DNA的切割、重组、合成、剪接、补平、连接和修饰是由一系列酶促反应所完成，有关的各种酶被统称为工具酶。 常用的工具酶主要有： 一、限制性核酸内切酶 二、DNA连接酶 三、DNA聚合酶 四、碱性磷酸酶 五、T4多核苷酸激酶 六、核酸酶S1 一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease ） 简称限制酶、内切酶 ，是一类能识别和切割双链DNA特定核苷酸序列的核酸水解酶。 分为三型。其中Ⅱ型限制酶是分子克隆技术中最重要的工具酶。 表3-1 三种限制性核酸内切酶的作用 （一）限制酶的命名与分类 （二）Ⅱ型限制性核酸内切酶的作用 Ⅱ型限制酶能识别双链DNA特异的核苷酸序列，通常4?6个碱基对，并在此序列内有特异切割位点。 Ⅱ型限制酶主要功能：根据需要在特定的位点上精确切割双链DNA分子。 限制性核酸内切酶在分子克隆中的用途： 切割DNA以获取目的DNA片段 切割载体DNA形成切口 使目的DNA片段能插入载体 是分子克隆的“分子手术刀” 一把特殊“剪刀”。 二、DNA连接酶（1967年发现） 作用：能够催化两个互补粘性末端或平末端双链DNA分子形成磷酸二酯键，实现DNA重组。 连接作用所需条件 (1)一条DNA链的3′-末端具有一个游离的-OH; (2)另一条DNA链的5′-末端具有一个磷酸基团-P; (3)需要辅酶NAD或ATP。 大肠杆菌DNA连接酶只能连接粘性末端，而T4DNA连接酶既能连接粘性末端，又能连接平末端。 连接酶在分子克隆中的用途: 能够催化外源DNA和载体分子之间发生连接作用,形成重组的DNA分子。 三、DNA聚合酶 共同特点：能够把脱氧核糖核苷酸(dNTP)连续地加到DNA链的3′-OH末端，催化脱氧核苷酸的5′→3′聚合作用。 DNA聚合酶Ⅰ Taq DNA聚合酶 逆转录酶 末端脱氧核苷酰转移酶 第二节 载体Vector 载体（vector）: 指能携带外源DNA片段导入宿主细胞进行扩增或表达的运载工具。载体的本质为DNA。 外源性DNA或目的基因片段必须与合适的载体连接形成重组体—重组DNA分子，才能进入受体细胞并进行复制和表达。 载体大都经过改造，理想的载体具备以下特征： ①能自我复制并具较高的拷贝数，分子量适宜，一般10Kb。 ②带有遗传筛选标记，如抗生素抗性基因。 ③具有多个限制酶的单一切点（称为多克隆位点 multiple cloning sites，MCS） ，容易插入外源基因。 载体包括克隆载体和表达载体。 克隆载体 能将外源基因在受体细胞中复制扩增并产生足够量目的基因的载体称为克隆载体。 常用的克隆载体： 质粒载体 噬菌体载体 粘粒载体（由质粒和噬菌体构建而成） 酵母人工染色体（YAC） 病毒载体 （一）质粒载体 质粒（plasmid）是指细菌染色体以外的小 分子环状双链DNA，能自我复制并表达其携带 的遗传信息。 常用的质粒载体有pBR322和pUC系列，它们的共同点： 可以克隆2kb的目的DNA。 受体细胞是大肠杆菌。 1、? pBR322质粒 是由一系列大肠杆菌质粒DNA通过DNA重组技术构建的一种双链环状克隆载体。 结构特点： 1）4.36kb，有一个高拷贝复制起点(ori)； 2）有2个抗性基因（Ampr和Tetr)； 3）抗性基因内分别