分子生物学 第七章生物分子的分离纯化.pptx

第七章

生物分子的分离纯化;生物大分子（蛋白质、核酸、糖复合物等）;3;4;5;;7;8;9;;11;12;13;化学破碎（ChemicalDisruption）;匀浆(Homogenization);超声(Sonication);17;影响提取效果的因素;pH值;盐浓度（离子强度）;温度;水解酶

;搅拌增加溶解，温和搅拌为宜，速度过快容易产生大量泡沫，增加与空气的接触面，会引起酶等物质的变性失活。

一般蛋白质都含有相当数量的巯基，有些巯基常是活性部位的必需基团，若提取液中有氧化剂或与空气中的氧气接触过多都会使巯基氧化为分子内或分子间的二硫键，导致酶活性丧失。

在提取液中加入少量巯基还原剂防止巯基氧化。

β－巯基乙醇（β-mercaptoethanol）

二硫苏糖醇(DTT)

还原型的谷胱甘肽（Glu-Cys-Gly）;有机溶剂提取;;沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程，根据不同物质在溶剂中的溶解度的不同而达到分离的目的。

盐析法

选择性沉淀法

有机溶剂沉淀法;生物大分子的分离纯化（一）沉淀法;盐溶、盐析

(Saltingin/Saltingout);硫酸铵沉淀

（Ammoniumsulfateprecipitation）;盐析的影响因素

;（2）有机溶剂沉淀法;有机溶剂沉淀;主要的不足之处常导致蛋白的变性失活，需低温操作。;有机溶剂沉淀的影响因素;（3）其他沉淀法;

将半透膜制成袋状，将生物大分子样品置于袋内，将透析袋浸入水或缓冲液中，样品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋内，而盐和小分子物质不断扩散透析到袋外，直到袋内外两边的浓度达到平衡为止。;通过透析从而到达溶质交换-除去沉淀剂;透析的动力是扩散压，扩散压是由膜两边的浓度梯度形成的。透析的速度反比于膜的厚度，正比于欲透析的小分子溶质在膜内外两边的浓度梯度，还正比于膜的面积和温度。

透析袋使用注意清洁，查漏。;;超滤分类操作压力和膜的孔径;超滤优缺点;生物大分子的分离纯化（四）样品的保存;生物大分子样品保存的影响因素;制备生物大分子的分离纯化方法多种多样，主要是利用它们之间理化性质的差异。;粗分离和精分离纯化方法选择;二、核酸的分离纯化;分离纯化的原则

一是保持核酸碱基序列的完整性。二是尽量清除其它分??的污染，保证核酸制品的纯度。;对于核酸的纯化应达到以下三点要求：

1）核酸样品中不存在过高浓度的金属离子和对酶有抑制作用的有机溶剂；

2）其它生物大分子如蛋白质、脂类和多糖分子的污染应降至最低程度；

3）排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时应去除RNA，提取RNA分子时应去除DNA。;保持核酸的完整性

在整个操作过程中应尽量避免各种有害因素对核酸的破坏。;核酸制备的技术路线;核酸的释放;核酸的分离与纯化;层析法离子交换，吸附层析，亲和层析;密度梯度离心法;核酸的浓缩、沉淀与洗涤;核酸的鉴定与保存;⑵荧光光度法：核酸在荧光染料溴化乙锭（ethidiumbromide，EB）嵌入碱基平面后，本身无荧光的核酸在UV激发下发出红色荧光，且荧光强度的积分与溶液中核酸的含量呈正比。;⒉纯度鉴定紫外分光光度法或荧光光度法皆可用于核酸制品的纯度鉴定。

⑴紫外分光光度法：该法主要通过A260与A280的比值来判定有无蛋白质的污染。在TE缓冲液中，纯DNA的A260/A280为1.8，纯RNA的比值为2.0。比值升高与降低均提示不纯。

⑵荧光光度法：用EB等荧光染料示踪的核酸电泳结果可判定核酸制品的纯度。DNA分子较RNA大得多，电泳迁移率低。;⒊完整性鉴定

⑴琼脂糖凝胶电泳法：以EB为示踪剂的核酸凝胶电泳结果为依据。基因组DNA片段如发生降解，电泳图呈拖尾状。完整的或降解很少的总RNA电泳图谱中，三条带的荧光强度积分应呈特定的比值，如有改变则提示有RNA的降解。此外，若在点样孔附近有着色条带，则说明存在DNA的污染。

⑵其它方法：必要时，还可通过一些特殊的实验来鉴定RNA的完整性。

如小规模的cDNA第一条链的合成反应，已知大小的某种mRNA的Northern杂交等;(1)对DNA

①DNA样品溶于pH8.0的TE，4℃或-20℃保存；在-70℃可保存数年

②长期保存样品中可加入1滴氯仿。

(2)对RNA

①RNA样品溶于0.3mol/LNaAc(pH5.2)或双蒸灭菌水中，-70℃保存;

②长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中;

③在RNA溶液中，加1滴0.2mol/LVRC(氧钒核糖核苷复合物)冻贮于-70℃,可保存数年。;尽管基因组DNA因来源、性质以及制备的目的不同，其分离纯化的方法不尽相同，但有关分