目的基因的克隆.ppt

A 鸟枪法 B cDNA法 C PCR法 D 化学合成法 E 基因文库的构建 化学合成法的基本战略 探针等寡聚核苷酸合成 某段连续的氨基酸序列 Cys Met Asp Glu Met Lys Arg Asn Ile 所有可能的DNA序列 TGTATGGACGAAATGAAAAGAAACATA C T GATG G G T T C CGA CGG CGT CGC 设计的简并探针序列 TGTATGGACGAIATGA TGTATGGATGAIATGA TGCATGGACGAIATGA TGCATGGATGAIATGA A G 此外还可以参考各种生物体的EST数据库进行倾向性简并序列设计 expressed sequence tag 化学合成的单元操作 化学合成DNA的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个个接上去，每接一个单体就是一个循环反应，包括：基团保护、分离、缩合、分离、去保护五大操作单元。 从反应机理上来讲，DNA化学合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸液三酯法；具体操作过程又有液相合成和固相合成两种形式。前者操作繁琐，基本上已淘汰；后者反应中间物的分离程序简便，DNA合成仪就是根据固相亚磷酸液三酯法原理设计的。 化学合成的单元操作 O H G H H H H O CH 2 O DMT P O Me N CH Me Me CH Me Me H DMT： 二甲氧基三苯甲基 激活 缩合 氧化 脱取代基 玻璃珠 连接臂 DNA化学合成的用途 合成天然基因 修饰改造基因 设计新型基因 制备探针、引物、接头 如生长激素释放抑制素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素 如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等 基因等 5 目的基因的克隆 基因文库的基本概念 基因文库的构建程序 基因组文库重组克隆的排序 基因文库的基本概念 基因库与基因文库 基因库（gene pool） 特定生物体全基因组的集合（天然存在） 基因文库（gene library or gene bank） 从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式 基因组文库（含有全部基因） 存在（人工构建）。根据构建方法的不同，基因文库分为： cDNA文库（含有全部蛋白质编码的结构基因） 基因文库的基本概念 基因文库构建的基本战略 用鸟枪法构建基因组文库，材料来自染色体DNA 用cDNA法构建cDNA文库，材料来自mRNA 在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNA 种类不同（即基因的表达谱不同），因此同种生物体的cDNA文库 一般还有组织细胞的界定，如肝组织cDNA文库或胚胎组织cDNA 文库等。很显然， cDNA文库的信息量远小于基因组文库。 基因文库的基本概念 基因文库的完备性 基因文库的完备性是指：在构建的基因文库中任一基因存在的概 率，它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示： N = ln ( 1 – P ) / ln ( 1 – f ) 其中： P = 任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率 f = 克隆片段的平均大小 / 生物基因组的大小 例如，人的单倍体DNA总长为2.9 x 109 bp，基因文库中克隆片段 的平均大小为15 kb，则构建一个完备性为0.9的基因文库至少需要 45万个克隆；而当完备性提高到0.9999时，基因文库至少需要180 万个克隆。 基因文库的基本概念 基因文库的质量标准 除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因文库应具备下列条件： 重组克隆的总数不宜过大 以减轻筛选工作的压力 载体的装载量最好大于基因的长度 避免基因被分隔克隆 克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域 以利克隆排序 克隆片段易于从载体分子上完整卸下 重组克隆能稳定保存、扩增、筛选 基因文库的构建程序 基因组DNA的制备 为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完整性， 用于基因组 文库构建的DNA在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂。制备的 DNA分子量越大，经切割处理后样品中含有不规则末端的DNA片段 的比率就越低，重组率和完备性也就越高。 A A A A 用常规方法制备的染色体 DNA的长度一般在100 kb左右 如果先将细胞固定在低融点凝 胶中，然后置入含有SDS、蛋 白酶K、RNase的缓冲液中浸泡，可获得1000 kb大小的DNA片段。 基因