第05讲++目的基因的分离与克隆.ppt

把重组的噬菌体?DNA或Cosmid质粒DNA包装成具有感染能力的?噬菌体颗粒。 6. 体外包装的噬菌体的转导 （1）体外包装（in vitro packaging） （2）转导（transduction） 通过受体菌细胞表面的?DNA接受器位点（receptor site)，使带有外源基因的重组体DNA注入受体大肠杆菌进行扩增。 cI857基因是个温度敏感性阻遏蛋白基因，感染细菌后，在32℃下培养细菌时能够保持溶源性。 但当温度升高到44℃-45℃时，就会导致cI基因编码的阻遏蛋白失活，?DNA复制、外壳蛋白合成。便于提取外壳蛋白。 （3）cI857基因突变的?噬菌体 但由于该噬菌体的S基因上有一个突变，所以细菌还不裂解。 cI857 其它基因 溶源状态（?DNA不转录、不翻译） ?DNA 阻遏 蛋白 阻遏 蛋白 44℃-45℃ ?DNA转录、翻译合成外壳蛋白 32℃ ?噬菌体1 外壳蛋白基因E发生了无义突变，不能合成头部蛋白，但能合成其它外壳蛋白（尾部蛋白）。 在cI857基因突变的?噬菌体的基础上，选择两种外壳蛋白的突变型?噬菌体。 （4）互补型噬菌体 外壳蛋白基因D发生了无义突变，不能合成头部的包装识别蛋白，但能合成其它外壳蛋白（头部、尾部蛋白）。 ?噬菌体2 (5) 体外包装过程 体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，使受体菌发生溶菌，形成噬菌斑。（每?g ?DNA能形成106噬菌斑）。 （6）转导 转化率高的菌株； 有突变的菌株（与导入的载体基因互补）； 不育的菌株（不会与其他酵母接合）。 第七节 外源基因导入真核细胞 一、导入酵母细胞 1. 菌株选择 如：ura3-52, trp1-289, leu2-3, leu2-112, his3?1 （1）利用原生质球进行转化 2. 酵母的转化方法 酵母 原生质体 感受态 酶去壁 CaCl2、 PEG 插入外源基因 的酵母载体 PEG（聚乙二醇）使细胞壁具有通透性，允许DNA进入。 CaCl2使细胞膜具有通透性，允许DNA进入。 转化 酵母 0.1mol/L LiCl处理 插入外源基因的酵母载体 感受态 40% PEG 4000 （2）利用Li+盐进行转化 叶盘 消毒 切取 土壤农杆菌浸泡 看护培养基 愈伤组织 分化幼苗 二、导入植物细胞 1. 叶盘法（leaf disk) 植物细胞 原生质体 纤维素酶和果胶酶 DNA 混合入电击缓冲液 1-2kV,3-25?F电击 愈伤组织 幼苗 分化 2. 电击法（electroporation) 又称高速微型子弹射击法（High-velocity microprojectiles) DNA 1.2?m钨弹头 吸附 特制手枪 射击植物 装入 3.基因枪法（gene gun） 4. 农杆菌（agrobacterium）介导 （详见另外章节） （1）原理： 三、导入哺乳动物细胞 1. 磷酸钙沉淀法 HEPES缓冲盐水与含有氯化钙和DNA的溶液缓慢混合，会形成含磷酸钙和DNA的沉淀。 依据不同的细胞类型，平皿上最多能有10%的细胞能吸收DNA沉淀。 不需要载体。 （2）特点： 脂质体有商业试剂盒（如Life Technologies）。 2. 脂质体（lipofectin）载体法 脂类包埋DNA，通过细胞膜进入细胞。 直接把外源DNA注射到宿主细胞核里，使其整合到染色体上。 3. 显微注射法(microinjection) 二乙氨乙基（diethyl-aminoehtyl，DEAE）葡萄糖能促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。 4. DEAE—葡萄糖传染法 葡聚糖 葡聚糖+DNA 吸附到细胞表面后被细胞吞入，部分DNA可以进入到细胞核里。 DEAE-dextran 细胞 外源DNA 预处理 摄入 DEAE-dextran 外源DNA 细胞 混合 DEAE-dextran对细胞有毒! 5. 病毒（virus）介导 （详见另外章节） 外源基因导入细胞的方法 * 目的基因：准备要分离、改造、扩增或表达的基因。 ④ 缺点： 1）可以用内切酶把插入片段切下来。 如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完整的插入片段 2）能给载体连接上Polylinker: ③ 优点： （3）DNA接头 (adapter)连接法 1978年康内尔大学的吴瑞教授发明。 5‘p-GATCCCGG-OH3’ GGCC-p5’ BamHI adapter 用T4DNA连接酶连到DNA分子的两端，直接成为人工粘性末端。 ① adapter 一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）。 ② adapter的作用 Blunt-ended DNA 5’p-GATCCCGG-OH3’