目的基因的克隆与基因文库的构建.ppt

从反应机理上来讲，DNA化学合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸液三酯法；具体操作过程又有液相合成和固相合成两种形式。前者操作繁琐，基本上已淘汰；后者反应中间物的分离程序简便，DNA合成仪就是根据固相亚磷酸液三酯法原理设计的化学合成DNA的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个个接上去，每接一个单体就是一个循环反应，包括：基团保护、分离、缩合、分离、去保护五大操作单元。010201化学合成的单元操作化学合成的单元操作MeOHGHHHHOCH2ODMTPOMeNCHMeCHMeMeHDMT：二甲氧基三苯甲基激活缩合氧化脱取代基玻璃珠连接臂合成天然基因修饰改造基因设计新型基因制备探针、引物、接头如生长激素释放抑制素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等基因等DNA化学合成的用途目的基因的克隆与基因文库的构建E基因文库的构建基因文库的基本概念基因文库的构建程序基因组文库重组克隆的排序cDNA文库（含有全部蛋白质编码的结构基因）基因组文库（含有全部基因）基因文库（genelibraryorgenebank）基因库（genepool）存在（人工构建）。根据构建方法的不同，基因文库分为：从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式特定生物体全基因组的集合（天然存在）基因库与基因文库基因文库的基本概念种类不同（即基因的表达谱不同），因此同种生物体的cDNA文库4一般还有组织细胞的界定，如肝组织cDNA文库或胚胎组织cDNA5用鸟枪法构建基因组文库，材料来自染色体DNA1用cDNA法构建cDNA文库，材料来自mRNA2在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNA3文库等。很显然，cDNA文库的信息量远小于基因组文库6基因文库的基本概念基因文库构建的基本战略基因文库的基本概念基因文库的完备性基因文库的完备性是指：在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示：N=ln(1–P)/ln(1–f)其中：P=任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率f=克隆片段的平均大小/生物基因组的大小例如，人的单倍体DNA总长为2.9x109bp，基因文库中克隆片段的平均大小为15kb，则构建一个完备性为0.9的基因文库至少需要45万个克隆；而当完备性提高到0.9999时，基因文库至少需要180万个克隆基因文库的质量标准01除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因文库应具备下列条件：02重组克隆的总数不宜过大以减轻筛选工作的压力03载体的装载量最好大于基因的长度避免基因被分隔克隆04克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域以利克隆排序05克隆片段易于从载体分子上完整卸下06重组克隆能稳定保存、扩增、筛选07基因文库的基本概念基因文库的构建程序基因组DNA的制备为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完整性，用于基因组文库构建的DNA在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂。制备的DNA分子量越大，经切割处理后样品中含有不规则末端的DNA片段的比率就越低，重组率和完备性也就越高AAAA用常规方法制备的染色体DNA的长度一般在100kb左右如果先将细胞固定在低融点凝胶中，然后置入含有SDS、蛋白酶K、RNase的缓冲液中浸泡，可获得1000kb大小的DNA片段5目的基因的克隆与基因文库的构建CPCR法BcDNA法A鸟枪法D化学合成法E基因文库的构建基因工程或DNA重组技术三大用途的前提条件是从生物体基因组中分离克隆目的基因，目的基因获得之后，或确定其表达调控机制和生物学功能，或建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌（细胞），或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回细胞内改良生物体的遗传性状，包括人体基因治疗。一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。5目的基因的克隆与基因文库的构建A鸟枪法5目的基因的克隆与基因文库的构建鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法操作的改进鸟枪法克隆目的基因的局限性鸟枪法克隆目的基因的基