目的基因的克隆—PCR法扩增目的基因片断.ppt

DNA的结构（1） DNA的结构（2） DNA的结构（3） DNA的复制（1） DNA的复制（2） DNA的复制（3） DNA的复制 和 体外的模拟 PCR循环--变性 PCR循环--变性 PCR循环--变性 PCR循环—退火 PCR循环—延伸 PCR循环—延伸 PCR循环—延伸 PCR循环—延伸 PCR整个过程 讨论1：为何酶促反应需要那么高的温度 讨论2：影响PCR质量的一些因素 讨论3：PCR的应用 讨论3：PCR的应用 讨论3：PCR的应用 讨论3：PCR的应用 实验步骤： ????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 二零零二年七月 第 * 页 / 共 8 页 黄旭、黄晨辉 目的基因的克隆— PCR法扩增目的基因片断 PCR(Polymerase Chain Reaction)，聚合酶链式反应,模拟了发生在细胞内的DNA复制的过程 三磷酸核糖核苷NTP 三磷酸脱氧核糖核苷dNTP 三磷酸双脱氧核糖核苷ddNTP A腺嘌呤 G鸟嘌呤 C胞嘧啶 U尿嘧啶 T胸腺嘧啶 五种碱基 A-T C-G 氢键维持了DNA的双螺旋结构 3’-OH进攻5’- ?Pi DNA聚合酶催化 DNA的延伸方向:5‘-3’ DNA复制相关蛋白 在复制起始点打开 双链DNA 然后DNA解链酶 结合到单链DNA上 进一步解开双链DNA 模板（母链） 细胞内源 外源加入 打开双链 解链酶 加热变性 维持单链 单链结合蛋白 高温 引物 引物合成酶 外源加入 底物dNTP 细胞内源 外源加入 聚合酶 细胞内源 外源加入 反应环境 细胞内环境 缓冲液 为了确保模板是单链，尤其是第一次反应的模板 防止非特异性的引物退火 延伸的温度必须大于退火温度，而小于变性温度 DNA聚合酶不能热变性，所以选用耐高温的聚合酶 常规用的PCR DNA聚合酶是从一种嗜热细菌分离出来的DNA聚合酶。酶活性在100 0C条件下，能保持几个小时。而其最适合酶促温度在72 0C左右。 模板:选用纯度较高的DNA作模板，杂质蛋白和RNA的存在都会影响到DNA聚合酶与引物和模板的结合。 目的片断：目的片断或者目的片断相邻的DNA含GC量较高，或者有重复序列存在，都会导致二级结构的存在。可在反应体系里加入DMSO，破坏模板的二级结构。 引物的设计：引物太短，要求退火的温度就低，错配的可能性就大，再者，两条引物不能存在较长的互补片断 。 酶：纯度、可信度，碱基错配率1/10000。 从蓝藻里面克隆SOD (超氧化物歧化酶) 清除人体内细胞中自由基 抗氧化、抗辐射、消炎、抗衰老、抗癌 高压氧中毒、肺气肿、糖尿病、早衰 食品、保健品、药品、化妆品 基因库检索 SOD的序列 ? 设计引物?以蓝藻总DNA位模板做PCR?获得的基因片断连接在表达载体?原核表达蛋白 检测粉末样品是否含 有炭疽杆菌 炭疽菌恐慌，降临美国，席卷全球 生命力强、传染快、发作快、死亡率高。 有两对引物是根据编码炭疽杆菌EF因子的基因序列设计的，仅与各种炭疽杆菌的EF因子同源。PCR产物是1247bp和208bp的片断。非炭疽杆菌均呈阴性。 用营养肉汤培养2小时?取培养液直接作PCR 基因测序 基因组计划首要任务就是测序 Sanger双脱氧法 ddATP-绿色荧光 ddTTP-红色荧光 ddCTP-蓝色荧光 ddGTP-橙色荧光 基因测序 ??????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????