PCR基因扩增概述.ppt

PCR基因扩增 实验四 一、实验目的 1）学习掌握PCR反应原理 2）掌握PCR技术的操作过程 3）通过PCR获得银杏黄酮代谢过程中的一个关键酶基因——CHS基因（查尔酮异构酶基因） 二、实验原理 类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。 三、实验试剂、材料、仪器 试剂：Taq DNA聚合酶，PCR缓冲液（含MgCl2），dNTP（每种2.5mmol/L）混合物，引物(终浓度各0.5mol/L) ；琼脂糖，50×TAE 缓冲液，无菌双蒸水等 材料：银杏DNA 仪器：微量移液器，吸头，0.2ml PCR薄壁管，PCR仪，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，微波炉等 四、操作步骤 1）取一个干净的PCR薄壁管 2）往PCR管里面加入各种试剂： Primer1 1μl Primer2 1μl DNA模板 3μl 10*buffer 3μl dNTP 2μl Taq酶 0.5μl 无菌ddH2O 19.5μl 3）设定好PCR反应程序如下： 95℃ 4 min 95℃ 50s 57℃ 1.0min 35 cycles 72℃ 2min 72℃ 10 min End 4）开始PCR 5）1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果 五、注意事项 １）PCR非常灵敏， 注意移液器的规范使用，保证各种反应试剂吸取的精确性。 ２）所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染；吸头、离心管应高压灭菌，每次吸头用毕应更换，不要互相污染试剂。 3） PCR的所用试剂应在冰浴上化开，并且要充分混匀 。 六、作业 1）将你PCR实验结果的电泳图片附在实验报告上，并根据图片分析你扩增的结果 2）思考：有哪些因素会影响PCR的质量？ DNA的结构（1） DNA的结构（2） DNA的结构（3） DNA的复制（1） DNA的复制（2） DNA的复制（3） DNA的复制 和 体外的模拟 PCR循环—退火 PCR循环—延伸 PCR循环—延伸 PCR循环—延伸 PCR循环—延伸 PCR整个过程 * 30μl 三磷酸核糖核苷NTP 三磷酸脱氧核糖核苷dNTP 三磷酸双脱氧核糖核苷ddNTP 补充：PCR 原理 A腺嘌呤 G鸟嘌呤 C胞嘧啶 U尿嘧啶 T胸腺嘧啶 五种碱基 A-T C-G 氢键维持了DNA的双螺旋结构 3’-OH进攻5’- ?Pi DNA聚合酶催化 DNA的延伸方向:5’-3’ DNA复制相关蛋白在复制起始点打开双链DNA，然后DNA解链酶结合到单链DNA上进一步解开双链DNA 模板（母链） 细胞内源 外源加入 打开双链 解链酶 加热变性 维持单链 单链结合蛋白 高温 引物 引物合成酶 外源加入 底物dNTP 细胞内源 外源加入 聚合酶 细胞内源 外源加入 反应环境 细胞内环境 缓冲液 PCR循环--变性 PCR循环--变性 PCR循环--变性