目的基因的PCR扩增及其扩增产物的鉴定.docx

目的基因的PCR扩增及其扩增产物的鉴定

1.实验原理

PCR（聚合酶链反应）是一种在体外模拟DNA复制过程的技术。它利用DNA模板、引物、四种脱氧核糖核苷酸（dNTPs）和DNA聚合酶，通过循环的温度变化，实现特定DNA片段的快速扩增。

2.实验材料

DNA模板：含有目的基因的DNA片段。

引物：设计针对目的基因两侧的特异性引物。

dNTPs：四种脱氧核糖核苷酸混合物。

TaqDNA聚合酶：耐热DNA聚合酶，用于在PCR反应中合成新的DNA链。

缓冲液：提供适宜的pH和离子强度，以维持DNA聚合酶的活性。

灭菌水：用于配制反应体系。

3.实验步骤

a.设计引物：根据目的基因序列，使用专业软件设计特异性引物，并考虑引物的长度、GC含量和Tm值。

b.配制反应体系：按照试剂说明书和实验设计要求，准确配制PCR反应混合物。

c.进行PCR扩增：

初始变性：将混合物在9498°C下变性510分钟，使DNA双链解旋为单链。

循环扩增：设置3040个循环，每个循环包括以下三个步骤：

变性：9498°C，3060秒，使DNA双链解旋。

退火：根据引物的Tm值设定温度，一般为5065°C，3060秒，使引物与模板DNA结合。

延伸：72°C，12分钟，DNA聚合酶沿模板链延伸，合成新的DNA链。

终末延伸：72°C，510分钟，确保所有的DNA片段都完全延伸。

d.结束反应：将PCR产物置于4°C或20°C保存。

扩增产物的鉴定

1.凝胶电泳分析

a.准备琼脂糖凝胶：根据需要分离的片段大小，选择适当浓度的琼脂糖凝胶。

b.样品制备：将PCR产物与上样缓冲液混合。

c.电泳分析：将样品加载到凝胶孔中，进行电泳。通常使用1×TAE缓冲液，电压为100150V。

d.结果观察：电泳结束后，使用紫外灯或成像系统观察凝胶，记录目的条带的大小和亮度。

2.序列分析

a.纯化PCR产物：使用DNA纯化试剂盒将PCR产物纯化。

b.送检测序：将纯化的PCR产物送至测序公司进行序列分析。

c.结果比对：将测序结果与已知基因序列进行比对，验证扩增片段的正确性。

3.酶切分析

a.选择合适的限制性内切酶：根据目的基因序列，选择能够识别并切割特定序列的酶。

b.酶切反应：将PCR产物与限制性内切酶混合，进行酶切反应。

c.电泳分析：酶切后，通过凝胶电泳分析酶切片段的大小和数量。