第七章植物基因工程.ppt

高等植物基因工程的发展历程 三、高等植物的基因转移系统 （1） Ti 质粒的图谱区 整个质粒160 -240 kb T-DNA区、Vir区、 Con区、Ori区 其中T-DNA 12 -24 kb tms的编码产物负责： 合成吲哚乙酸 tmr的编码产物负责： 合成植物分裂素 tmt的编码产物负责： 合成氨基酸衍生物冠瘿碱 （5）Ti 质粒致瘤的分子机制： 损伤的植物根部会分泌出乙酰丁香酸和羟基乙酰丁香酸，它们能诱导Ti质粒上的vir基因以及根瘤菌染色体上的一个操纵子表达。vir基因产物将Ti质粒上的T-DNA单链切下，而根瘤菌染色体上的操纵子表达产物则与单链T-DNA结合形成复合物，转化植物根部细胞。 （6）T-DNA的染 色体整合机制 3、 共 整 合 转 化 程 序 双元系统的特点是两个质粒即穿梭质粒和Ti质粒，在接合后可以自主性地共存于同一农杆菌细胞中。 穿梭质粒编码植物选择标记，表达信号，并具有位于两个T-DNA边界序列之间的用于外源基因的多克隆位点。 双元系统中的农杆菌质粒是一个经过改造的Ti质粒，具有Vir基因和农杆菌复制起始子(OriA)，但没有T-DNA边界序列。 接合后，两个质粒在选择压下可以自主共存于同一农杆菌细胞中。当农杆菌感染受伤的植物时，Ti质粒上的Vir基因与穿梭质粒上的左右边界序列发生相互作用，从而将T-DNA转移进入植物基因组。 插入外源基因的重组穿梭质粒直接转化含有Ti质粒的根瘤农杆菌，经筛选后直接感染植物细胞。 与共整合系统所不同的是，含外源基因的质粒可在农杆菌内自主复制并保留下来。农杆菌侵染植物细胞后，植物的创伤信号启动Ti质粒上的Vir基因，随后将穿梭质粒的T-DNA切割下来，转移到植物细胞中。 培养2-3周后，将滤纸上的植物细胞蔟转移至含有高浓度分裂素和低浓度生长素的固体培养基上继续培育2-4周，滤纸片上便长出嫩芽；将嫩芽置入含有低浓度生长素而无分裂素的固体培养基上，使其根部发育；大约3周后再将之移植在土壤中，长成整株植物。 植物原生质体的再生程序 四. 转基因植物的基因鉴定 五、植物基因工程的应用 （一）利用转基因技术研究基因的表达与调控 转报告基因研究植物基因的表达与调控 报告基因（reporter gene ）：是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。 报告基因条件： (1)已被克隆和全序列已测定； (2)表达产物在受体细胞中不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物； (3)其表达产物能进行定量测定。 目前植物中常用的报告基因： （1）大肠杆菌的β-葡萄糖苷酸酶（GUS） 该酶能催化许多β–葡萄糖苷酯类物质的水 解，将其与 X–葡萄糖苷酸（X-gluc）保温，产生 蓝色反应，借此可预测报告基因的表达程度。 （2）昆虫的荧光素酶基因 昆虫荧光素和ATP以及表达荧光素酶的植物细 胞混合，该酶催化昆虫荧光素的氧化反应，并生成 AMP、CO2和光，表达该酶的植物细胞或组织便 可用感光胶片检测。 2、植物生物反应器生产医用蛋白 转基因烟草表达小鼠抗体：利用农杆菌介导的转化系统，将小鼠抗体的轻链和重链编码基因分别置于两种烟草植物体内表达，然后两种重组植物品系进行杂交，产生的子代植物能同时合成小鼠的轻链和重链两种多肽。从转基因烟草的叶子可检测到完整的抗体分子，含量为叶细胞蛋白总量的1.5%。实验结果表明，植物细胞的蛋白分泌系统能有效识别小鼠抗体前体的信号肽序列。 转基因烟草表达人葡萄糖脑苷脂酶 人葡萄糖脑苷脂酶（hGC）是治疗高歇斯症（Gausher’s disease）遗传病的特效药，可能也称得上当今世界最昂贵的药物。每生产一个剂量的hGC要消耗2000-8000只人类胎盘，因此这种药物一直供不应求。美国VPI研究机构的专家将克隆的hGC基因经改造导入到烟草中，并获得高效表达。在每克这种转基因烟草的新鲜叶片中，hGC的含量竟高达1mg，也就是说，从一株转基因烟草中就能产生出传统工艺需要消耗数千只胎盘才能获得的药物。 高歇斯症(Gauchers diseasa,GD),又名葡萄糖脑苷脂沉积病,是溶酶体贮积病中最常见的一种,是由于葡萄糖脑苷脂酶(glucocerebrosidase,GBA)的活力明显降低,致使葡萄糖脑苷脂蓄积于单核-巨噬细胞及脑组织内,形成形态特异的高歇斯细胞,随病情发展并发血细胞减少、神经系统症状及骨骼病变等. 3、利用植物生物反应器生产食品或饲料添加剂 转基因烟草和马铃薯生产果聚糖