海洋生物技术第七章基因工程的下游技术精要.ppt

高效液相色谱 色谱技术各论 高效液相色谱法( , )，又称高压液相色谱法 、高速液相色谱法、现代液相色谱法等，是在经典液相色谱和气相色谱的基础上发展起来的分析技术。适用于高沸点、不能气化或热稳定性差的有机物分离分析，应用广泛。 工作原理：高压泵将贮液罐的溶剂经进样器送入色谱柱中，然后从检测器的出口流出。当待分离样品从进样器进入时，流经进样器的流动相将其带入色谱柱进行分离，按先后顺序进入检测器，由记录仪记录。 二、的特点 在高压下使液体通过色谱柱，在室温条件下分离混合组分，经检测器转变成电信号，由记录器描记或数据处理装置显示测定结果，具有高压、高速、高效、高灵敏度等特点。 ①高压：是以液体作为流动相，通过色谱柱时所受的阻力比较大，必须施加高压。一般为，最高可达。 ②高速：采用高压后，使流动相液体的流速加快，一般分析周期为数分钟至数分钟，比经典的液相柱色谱要快得多。 ③高效：的柱效较高(每米塔板数可达)，有时一根柱子可分离数十种乃至上百种组分。 ④高灵敏度：采用灵敏的检测器和自动化装置，可检出乃至 的物质；所需试样量很少，通常只需数十微升试样即可进行全分析。 操作过程演示 配制流动相 把二次蒸馏水和色谱纯级甲醇以：的比例混合 取混合均匀的溶液， 经μ的有机膜过滤，再脱气分钟即可 操作过程演示 更换色谱柱 把流动相贮液器放置在略高于高压泵的位置，插入带有不锈钢滤芯的输液管 开启高压泵电源开关，打开排放阀 设置流动相比例和流速等参数 揿下高压泵启动鍵“”，再按“”鍵，仪器开始清洗高压泵和排除管路中的气泡 。 观察废液出口，若没有气泡，按“”鍵，停止排放，关闭排放阀。 打开检测器电源开关，设置检测波长 操作过程演示 仪器运行平衡后，用液相进样针进样，一般为定量管的倍。 工作站对所注射样品进行分析测试，并绘制分离色谱图。 色谱工作站对测试数据进行计算，并将结果在屏幕上显示出来 操作过程演示 液相色谱法分析流程 高压输液泵将贮液器中的流动相以稳定的流速（或压力）输送至分析体系，在色谱柱之前通过进样器将样品导入，流动相将样品依次带入预柱、色谱柱，在色谱柱中各组分被分离，并依次随流动相流至检测器，检测到的信号送至工作站记录、处理和保存。 高压输液系统 贮液器 材质：玻璃、不锈钢、氟塑料或特种塑料聚醚醚酮（） 容积：～ 放置位置：高于泵体，保持一定的输液静压差 注意：密封、过滤 高压输液系统 高压输液泵 要求：泵体材料能耐化学腐蚀；能在高压（～）下连续工作；输出流量稳定（±），无脉冲，重复性高（±），而且输出流量范围宽；适用于梯度洗脱。 类型：一般可分为恒压泵和恒流泵两大类 高压输液系统 流动相过滤与脱气装置 流动相过滤装置 分为在线过滤和真空过滤 流动相脱气装置 分为在线真空脱气和超声波脱气 六通阀进样器：用于固定体积进样 进样系统 六通阀进样示意图 进样系统 液相色谱进样针：其针头为平头，以免扎破六通阀管路。用于可变体积进样 自动进样器 分离系统 色谱柱 分离系统的主要部件是色谱柱，柱效高、选择性好、分析 速度快是对色谱柱的一般要求。安装和更换色谱柱时一定要使流动相能按箭头所指方向流动。 一般在色谱柱前要求安装保护柱，起到保护延长分析柱寿命的作用。有些物质的分离条件要求有一定的温度，因此，给色谱柱配一个柱温箱是非常有必要的。 检测系统 解： 分类 通用型：示差折光检测器（）、电导检测器（）和蒸发光检测器（）,它们检测物质总体物理性质的变化情况 专用型：紫外检测器（）、荧光检测器（）， 它们检测某一物理或化学性质的变化 数据处理系统（工作站） 打开工作站，选择工作通道 编辑方法文件，设置方法名称、运行时间及定量方法 输入路径名、样品名、操作者等 样品分离完成后，记录谱图文件名和色谱峰峰高、峰面积和保留值等 介质：滤纸 操作方法：将试样溶于适当溶剂中，点样于滤纸的一端；选用适当的展开剂，借助毛细管现象从点样的一端向另一端流动，展开结束后，取下滤纸，晾干，染色显迹。 、纸色谱 （一）原理 滤纸一般能吸收～的水，其中 ～ 的水是以氢键与滤纸纤维上的羟基结合，较难脱去。纸色谱实际是以滤纸纤维的结合水为固定相，而以有机溶剂(与水不相混溶或部分混溶)作为流动相。展开时，有机溶剂在滤纸上流动，样品中各物质在两相之间不断地进行分配。由于各物质有不同的分配系数，移动速度不同，从而达到分离的目的。 溶质在滤纸上移动的速率可用值（阻滞因数）表示： 式中：溶质斑点中心的移动距离 ：溶剂前沿移动的距离 值决定于被分离物质在两相间的分配系数以及两相间的体积