第七章 基因工程 重组体克隆的筛选和鉴定课件.ppt

三、杂交抑制转译法 mRNA一旦与DNA杂交成RNA-DNA双链后就不能被核糖体翻译出蛋白质（转译被抑制）。 单链mRNA 核糖体 小亚基 核糖体 大亚基 能翻译 mRNA DNA 核糖体 小亚基 核糖体 大亚基 不能翻译 1. 原理 利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。 根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性质可分为几种作用方式： 一、放射性抗体检测法 第五节 免疫化学检测法 1. 抗体与产物的结合方式 对表达产物的检测。蛋白——蛋白“杂交” 待测基因 产物蛋白 一抗 二抗 125I 标记的二 抗结合蛋白 固相支持滤膜 待测基因 产物蛋白 一抗 125I标记的二抗 固相支持滤膜 待测基因 产物蛋白 一抗 固相支持滤膜 固相支持滤膜 待测基因 产物蛋白 一抗 二抗 125I 标记的二抗 结合蛋白 125I标记的二抗 2. 放射性抗体检测法过程 3. Broome-Gilbert双位点检测法 质粒基因A 插入基因B 表达 质粒蛋白A 外源蛋白B 融合蛋白 检测融合蛋白。 既检测外源基因产物又检测载体基因产物。 固相支 持滤膜 抗A抗体 125I标记的 抗B抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B 质粒蛋白A 外源蛋白B 固相支 持滤膜 抗A抗体 发光，底片曝光 二、免疫沉淀检测法 把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时，就会与抗体反应形成“沉淀圈”。 1. 原理 抗原—抗体 凝集反应。 检测分泌型产物。 2. 方法 对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。 三、酶联免疫吸附测定（ELISA） Enzyme-linked immunosorbant(免疫吸收剂)assay 1. 原理： 一抗（primary antibody）: 与目标分子的特异结合。 二抗（secondary antibody）： 与一抗的特异性结合。 酶连（enzyme-linke）： 二抗上携带一种酶能催化一种反应将无色的底物转变为有色的物质（或发光），再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子的含量。 待测基因 产物蛋白 一抗 二抗 酶 待测基因 产物蛋白 一抗 二抗 无色的底物 有色的产物 比色观察 酶 2. ELISA检测的一般步骤 （1）固定样品 将待测样品加入96孔微量滴定板（microtiter plate）的孔中，干燥后就被固定在孔底。 孔底 加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。 （2）一抗结合 一抗 加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗掉。二抗只识别一抗。 二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物酶、脲酶等）。 （3）二抗结合 二抗 加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应转变成有色物质（或发光）。 （4）显色反应 在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，打印出结果。 （5）比色 3.ELISA的局限性 有效，但准确性稍差（主要取决于一抗的特异性）。 必须与其他方法一起综合考虑。 最好用单克隆抗体（monoclonal antibody）:由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。 临床检验常用的单抗 四、免疫印迹（western blotting）法 1.原理： 在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方法检测胶上的蛋白质泳带。 （1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质维持线性状态，并与蛋白质结合，使蛋白质带上负电荷。 ① SDS: （SDS）： ② 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）： （Polyacrylamide gel electrophoresis） 在电场的作用下线性蛋白质链在聚丙烯酰胺凝胶介质中向正极移动，移动的速率主要取决于其分子量大小（链的长短），从而把不同分子量的肽链分开。 电泳buffer 电泳buffer 点样 电泳方向 ③蛋白质电泳的分子量标准 已知分子量的蛋白质混合液，与待测样品一起电泳，为样品蛋白质提供分子量估计。 商品化供应 Da 道尔顿(质量单位, 等于一氧原子质量的十六分之一。 一克约为6×1023道尔顿 Dalton ④凝胶中的蛋白质染色： 考马斯亮蓝： 灵敏度低、只能检出0.3-1μg/带，但可褪色回收。 硝酸银： 灵敏度高、可检出2-5ng/带。 2）转到膜上进行染色。 1）直接染色 直接染色电泳结果 （2）Western blotting 电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转到膜上（硝酸纤维素膜、PVDF膜、中性尼龙膜等）。 ① Western（转膜） 胶里的蛋白质带在电场的作用下横向转移到正极一侧的膜上。 膜 胶 蛋白 Weste