2017整理h第七章 重组体克隆的筛选和鉴定.ppt

第七 章 重组体克隆的筛选和鉴定p205 第一节 载体表型选择法 2. pBR322抗菌素标记选择 3. 选择过程： （2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程 二、?-半乳糖苷酶显色反应选择法 2. 选择过程 第二节 根据插入基因的表型选择 2. 增加新性状 第三节 DNA电泳检测法 二、酶切电泳筛选法 不同克隆的酶切结果 筛选过程 三、PCR扩增检测法 第四节 核酸杂交检测法P107 二、核酸杂交检测方法 Southern blotting Southern blot 筛选结果 （1）菌落杂交P109 （2）R-环检测法 2. Northern blotting 第五节 免疫化学检测法 P206 2. 放射性抗体检测法过程 3. Broome-Gilbert双位点检测法 四、免疫印迹（western blotting）法P108 ② 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）： ③蛋白质电泳的分子量标准 ④凝胶中的蛋白质染色： 直接染色电泳结果 （2）Western blotting Western装置 ② Blotting ③ Blotting过程 ④结果 第六节 转译筛选法 二、转译筛选 三、杂交抑制转译法 2. 过程 四、杂交释放转译法 2. 过程 五、DNA-蛋白质相互作用筛选法 一般克隆与筛选策略 第七节 几种常用的真核生物重组基因选择方法 ②氨甲喋啉（Methotrexate）的抑制作用 ④胸苷酸激酶的补救作用 （2）TK选择过程 2. 二氢叶酸还原酶基因（DHFR） DHFR+细胞 DHFR- 细胞 ② 胸腺嘧啶和次黄嘌呤补救 （2）选择过程 3. 新霉素抗性基因（neor） ③ 新霉素抗性基因--neor （2）选择过程 4. 氯霉素乙酰转移酶（CAT） （5） CAT分析方法 二、植物转化体报道基因筛选法 2. 几种报道基因的作用原理 Fireflies emit light catalyzed by luciferase with ATP 转入萤火虫的luciferase的烟草 烟草叶片表达B型肝炎抗原 植物细胞中适用的报道基因 dUMP dATP TTP dATP 次黄嘌呤 补救 胸苷 补救 无四氢叶酸提供甲基，dNTP合成受阻时， 胸腺嘧啶和次黄嘌呤分别补救: DHFR-细胞株（不能在无核苷酸的培养基中生长）。 ① 宿主细胞 透析除去血清中的内源性核苷酸，以免补救。 ② 无核苷酸的培养基 需要胸腺嘧啶和次黄嘌呤补救！ ③ 氨甲喋呤“加压” 添加少量氨甲喋啉抑制内源性DHFR的补救作用，可提高选择。 DHFR+基因。 ④ 载体标记 只有转入DHFR+基因的细胞才能生存。 DHFR- DHFR- DHFR+ DHFR+ live die 无核苷酸的培养基 是细菌抗生素，干扰细菌的核糖体，使细菌的蛋白质合成不能正常进行，但不影响真核生物。 （1）选择原理 ① 新霉素（neomycin） 新霉素的类似物，是一种 氨基糖苷，对真核细胞和原核细胞都有毒性。 ② G418（geneticin） 细菌的新霉素抗性基因（neor）编码一种磷酸转移酶（APH），能使G418失活。 G418 真核细胞 死亡 G418 存活 neor 真核细胞 含致死剂量G418的完全培养基。 ① G418培养基 真核细胞株均可。 neor基因。 ②宿主细胞 ③载体标记 G418：（100-800?g/mL） CAT是由大肠杆菌转座子Tn9编码的，催化氯霉素发生乙酰化失活。 氯霉素 cat 含氯霉素的完全培养基。 真核细胞株均可。 cat基因。 乙酰氯霉素 （1）选择原理 （2） 选择条件 （3） 宿主细胞 （4）载体标记 chloramphenicol acetyl transferase 在转化的细胞提取物中测定是否有乙酰氯霉素。 ② 免疫学检查： 用抗CAT的血清进行Western blot或ELISA，检查CAT的表达。 Anti-CAT Antiserum is available from Invitrogen. Other kits to assay for CAT protein using ELISA assay are available from Roche Molecular Biochemicals and Molecular Probes. ① 分析乙酰氯霉素 （1）大肠杆菌的β-D-葡萄糖醛酸糖苷酶 （β-D-glucuronidase，GUS）； （2）细菌和萤火虫的荧光素酶 （luciferase）； （3）水母绿色荧光蛋白（GFP）基因 （Green Fluorescent Protein）。 1. 报道基因（reporter gene) （4）其它 4