第二章基因工程的酶学基础.ppt

5’?3’外切酶活性从DNA切口的下一段DNA5’端除去一个核苷酸后，聚合酶活性就会在切口的上一段DNA的3’一侧补上一个新的核苷酸。 切口 切口 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 纯化的DNA片断 DNase I 制造单链切口 DNA Pol I 进行切口转移 一种?-32P-dNTP和dNTPs 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 32P-dNTP 32P-dNTP 从头至尾都被标记 8 2. Klenow fragment 具有5’?3’聚合酶活性和3’?5’外切酶活性。（失去了5’?3’外切酶活性）。 （1）Klenow fragment的性质 DNA Pol I ? Klenow fragment (76KD） 枯草杆菌蛋白酶 ① 3’端补平 5’ 5’ klenow ② DNA 3’末端标记 补平限制性内切酶切后形成的3’隐蔽端。 在3’隐蔽端加上放射性标记的dNTP。 klenow （2）主要用途 3’隐蔽末端的DNA片断 Klenow fragment补平 根据末端的顺序选择一种 ?-32P-dNTPs 末端标记的DNA 限制性内切酶切 5’----G3’ 3’----CTTAA5’ 5’----GAA3’ 3’----CTTAA5’ 5’----GAATT3’ 3’----CTTAA5’ 5’----G3’ 3’----CCTAG5’ 5’----GG3’ 3’----CCTAG5’ 5’----GGATC3’ 3’----CCTAG5’ EcoR I BamH I ?-32P-dATP ?-32P-dGTP 25oC 1h ③ cDNA第二链的合成 mRNA cDNA第一链 逆转录 cDNA第二链 klenow 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 引物 （1） T4 DNA聚合酶的性质 3. T4 DNA聚合酶 从T4噬菌体感染后的大肠杆菌培养物中分离纯化。由噬菌体基因43编码。 有5’?3’聚合酶活性和3’?5’外切酶活性（降解单链更快）。 ① 来源 ② 酶活性 ③ 特点 当没有dNTP时，T4DNA聚合酶行使3’?5’外切酶功能，制造出3’隐蔽端。 如果只有一种dNTP，则降解到该dNTP的位置。 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ T4 DNA聚合酶 无dNTPs T4 DNA聚合酶 有dNTPs 5’ 5’ （2） T4 DNA聚合酶的用途 标记末端（取代合成法） 用3’?5’外切酶活性作用于所有末端形式的3’端（平端、3’隐蔽端、5’隐蔽端）制造出3’隐蔽端。 再利用它的5’?3’聚合酶活性补平，并加入放射性标记的dNTP。 ① 补平隐蔽末端 ② DNA 3’末端标记 酶切中间产生两个末端标记 加入某种32P-dNTP和dNTPs T4 DNA聚合酶 （3’?5’外切） DNA酶切片断 T4 DNA聚合酶 （5’?3’聚合） 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 内切酶切 无dNTPs a. 放射性标记的优缺点： 制作简单、 高比放射性、 放射自显影效果好。 优点： 缺点： 半衰期短（32P只有14.3天）、 不易保存、 对人体有害。 要求在专门实验室操作。 b. 非放射性标记 i）生物素标记： 生物素（biotin），又称维生素H、辅酶R 可以与dNTP酰化结合成为生物素-1,6-dUTP、生物素-1,4-dATP、生物素-1,1-dUTP等。 CH2-CH-NH-CO-NH-CH-(CH2)4-COOH 也可以被生物素连接酶（biotin ligase）催化与蛋白质共价结合。 纯化的DNA片断 DNase I 制造单链缺口 DNA Pol I 进行缺口转移 生物素-dTTP和dNTPs 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 生物素-dTTP 生物素-dTTP 利用缺口转移法将生物素掺入DNA探针中 光促生物素标记 生物素 连接臂 光敏基因 探针序列 探针序列 生物素 连接臂 光敏基因 + 光照 抗生物素蛋白（avidin）： 链霉抗生物素蛋白（streptavidin）： 生物素的识别——亲和素： 是一种鸡卵清蛋白。 细菌中avidin的类似物。 能与生物素特异结合的蛋白或抗体，常用： ii）地高辛标记： 可以与dNTP连接成地高辛-dUTP等，参入DNA合成过