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第二章 基因工程的酶学基础 第一节 限制性核酸内切酶 一、限制性核酸内切酶 是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4—8bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。 1. 来源 原核生物。 2. 性质 内切酶。 即在核酸分子链的内部制造切口的酶。 3. 功能 自我保护作用。 细菌的限制和修饰系统（R/M体系） （1）限制（Restriction） 限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。 （2）修饰（Modification） 细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。 ① Dam甲基化酶 GATC 腺嘌呤N6位置引入甲基 ② Dcm甲基化酶 CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引入甲基 二、限制性内切酶的类型 目前鉴定出四种不同类型的限制性内切酶。 I 型限制性内切酶 II 类限制性内切酶 III类限制性内切酶 Ⅳ类限制性内切酶 1. I型限制性内切酶 首先由M. Meselson和R. Yuan在1968年从大肠杆菌 B株和 K株分离的。 如 EcoB和 EcoK。 （1）识别位点序列 未甲基化修饰的特异序列。 EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC （2）切割位点 在距离特异性识别位点约1000—1500 bp处随机切开一条单链。 （3）作用机理 需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。 2. II类限制性内切酶 首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。 分离的第一个酶是Hind Ⅱ （1）识别位点序列 未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是回文序列）。 与DNA的来源无关。 各种限制酶的识别序列一般都具有回文结构(palindrome) 各种限制酶的识别序列一般都具有回文结构(palindrome) 正读与反读都相同。 以识别序列的中线为对称轴，左右两侧的碱基互补。 为便于书写，识别序列可以5’ →3’走向的单链DNA表示。 （2）切割位点 识别位点处。 切开双链DNA。形成粘性末端（sticky end）或平齐末端（blunt end）。如： EcoR I 5’-G(AATTC-3’ 3’-CTTAA(G-5’ Pst I 5’-CTGCA(G-3’ 3’-G(ACGTC-5’ 产生粘性末端 EcoR V 5’-GAT(ATC-3’ 3’-CTA(TAG-5’ 产生平齐末端 （3）粘性末端（sticky ends，cohensive ends） 含有几个核苷酸单链的末端。 分两种类型： ① 5’端凸出（如EcoR I切点） ② 3’端凸出（如Pst I切点） （4）粘性末端的意义 ①连接便利 i）不同的DNA双链： 只要粘性末端碱基互补就可以连接。 这比连接两个平齐末端容易的多。 ii）同一个DNA分子内连接： 通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。 ② 5’末端标记 凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。 凸出的3’端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。 ③ 补平成平齐末端 粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。 （4）同裂酶（Isoschizomers) 识别位点的序列相同的限制性内切酶。 ① 完全同裂酶： 识别位点和切点完全相同。 如Hind Ⅲ 和Hsu I。 Hind Ⅲ 5’-A(AGCTT-3’ 3’-TTCGA(A-5’ Hsu I 5’-A(AGCTT-3’ 3’-TTCGA(A-5’ ② 不完全同裂酶： 识别位点相同，但切点不同。 如Xma I 和 Sma I。 Xma I 5’-C(CCGGG -3’ 3’-GGGCC(C-5’ Sma I 5’-CCC(GGG-3’ 3’-GGG(CCC-5’ 识别位点相同，但切点不同。 如Xma I 和 Sma I。 （5）同尾酶(Isocaudamers） 识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamH I、Bgl Ⅱ、Bcl I、Xho Ⅱ等 同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。 （6）限制酶的酶活性 限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强