第二章 基因工程制药 part3.ppt

浓缩、干燥及保存 液态贮藏 这种方法对保持生物大分子活性是不利的，有些样品在溶液中会较短的时间内分解或失活，液态保存时应注意以下几点： 样品不能太稀 一般需加入防腐剂和稳定剂 贮藏温度要严格按照要求，绝对不能乱放，有些样品只能贮藏于0~4℃冰箱，有些可贮藏于-20℃冰箱，有的可贮藏与-80℃冰箱甚至液氮中，应视不同物质而定。 蛋白质的定量 蛋白质是一种十分重要的生物大分子，它的种类很多，结构不均一，分子量相差很大，功能各异，要建立一个理想而又通用的蛋白质定量测定的方法是很困难的。下面列出根据其不同性质建立的一些蛋白质测定方法： 物理性质 紫外分光光度法 化学性质 凯式定氮法、双缩脲法、Lowry法、BCA法、胶 体金法 染色性质 考马斯亮蓝染色法、银染法 其他性质 荧光法 DNA、RNA的定量 用紫外分光光度计测定260nm和280nm两个波长的光吸收，然后，按1A260相当于50 μg/ml双链DNA、40 μg/ml单链DNA或RNA及20μg/ml单链寡核苷酸，计算样品含量。260nm和280nm两处读数的比值（A260/A280），可反映核酸的纯度。 DNA和RNA 纯品的A260/A280值分别为1.8和2.0，如果 样品中有蛋白质或酚的污染，则A260/A280将明显低于此值，此时就无法对样品中的核酸进行精确定量。 蛋白质的鉴定 浓度鉴定 DNA、RNA 的定量 纯度鉴定 分子量测定 等电点测定 活性测定 蛋白质的鉴定 纯度鉴定 电泳法：SDS(聚丙烯酰胺凝胶电泳)，IEF(等点聚焦电泳) 化学法：N-端测定，C-端测定 仪器法：HPLC，质谱，氨基酸组成分析 分子量测定 SDS凝胶过滤 氨基酸组成分析 毛细管电泳 蛋白质的鉴定 等电点测定 等电聚焦电泳 活性测定 激酶：标记ATP 磷酸化酶：定磷 利用靶酶活性 氧化还原酶 ELISA（酶联免疫吸附剂测定） GM-CSF 下游生产工艺流程 离子交换层析 离子交换层析的基本原理 离子交换介质的基本性质 离子交换层析的基本操作 离子交换介质的选择原则 离子交换层析的基本原理 离子交换层析（ion-exchange chromatography，IEC） IEC是以蛋白质分子净电荷和表面电荷分布为分离基础 的。具体说就是利用蛋白质带电性的差异，在离子吸附剂上 静电吸附能力不同，用不同的pH/离子强度洗脱液洗脱，从而使蛋白质分离的柱层析方法。 离子交换层析是以离子交换剂为固定相，以特定的含离子溶液为流动相，利用离子交换剂对待分离的各种离子结合力的差异，而将混合物中不同离子进行分离的层析技术。 离子交换层析 通过DEAE-纤维素将两种不同带电性的蛋白质分离开 图中显示的是带正电的离子交换树脂结合带负电的蛋白 离子交换介质的基本性质 离子交换剂亦称离子交换介质，通常是一种不溶性高分 子化合物，如树脂，纤维素，葡聚糖，醇脂糖等。 离子交换剂中所含的可解离基团在水溶液中能与溶液中 的其它阳离子或阴离子起交换作用 如果有两种以上的成分被吸附在离子交换剂上，则在用 洗脱液洗脱时各成分被洗脱的可能性取决于各自反应的 平衡常数 离子交换剂的基本性能 离子交换介质的基本性质 吸附在离子交换剂上的蛋白质可通过改变pH使吸附的蛋 白质失去电荷而解离下来 不同蛋白质与离子交换剂之间形成离子键数目不同，即 亲和力大小有差异，因此只要选择适当的洗脱条件便可 将混合物中的成分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的 离子交换剂的基本性能 离子交换介质的基本性质 阳离子交换剂：强酸性和弱酸性 可电离的基团 磺酸基（-SO3H） 磷酸基（-PO3H2） 羧酸基（-COOH） 酚羟基（-OH） 阴离子交换剂：强碱性和弱碱性