第二章 基因工程制药 part1课件.ppt

第二章 基因工程技术制药 一、概 述---几个概念 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在大肠杆菌中的表达 核糖体结合位点 核糖体结合位点 外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。 大肠杆菌细胞中结构不同的mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达数百倍。 mRNA 翻译的起始效率主要由其5’端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS） 核糖体结合位点 核糖体结合位点 大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素： 位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列5‘UAAGG AGG 3’即Shine-Dalgarno（SD）序列，他通过识别大肠杆 菌核糖体小亚基中的16S rRNA 3’端区域3‘AUUCCUCC 5’ 并与之专一性结合将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻 译； 翻译起始密码子，大肠杆菌绝大部分基因以AUG作为阅读 框架的起始位点，有些基因也使用GUG或UUG作为翻译 起始密码子 SD 序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成 基因编码区5’端若干密码子的碱基序列 核糖体结合位点 核糖体结合位点对外源基因表达的影响 SD序列的影响 一般来说mRNA与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效 率就越高，而这种结合程度主要取决于SD（UAAGGAGG） 序列与16S rRNA 的碱基互补性，其中以GGAG四个碱基序 列尤为重要。对多数基因而言，上述四个碱基序列尤为重 要。对多数基因而言，上述四个碱基中任何一个换成C或T， 均会导致翻译效率大幅度降低。 核糖体结合位点对外源基因表达的影响 SD序列与起始密码子之间的序列影响 SD序列下游碱基若为AAAA或UUUU，翻译效力最高； 而CCCC或GGGG 的翻译效率则分别最高值的50%和25%。 紧邻AUG的前三个碱基成份对翻译起始也有影响。 对于大肠杆菌β-半乳糖苷酶的mRNA 而言，在这个位置 上最佳的碱基组合是UAU或CUU，如果用UUC、UCA或 AGG取代之，则酶的表达水平低20倍。 核糖体结合位点 核糖体结合位点对外源基因表达的影响 SD序列与起始密码子之间的距离的影响 SD序列与起始密码子AUG之间的精确距离保证了mRNA 在核糖体上定位后，翻译起始密码子AUG正好处于核糖 体复合物结构中的P位，这是翻译启动的前提条件。 在很多情况下，SD序列位于AUG之前大约七个碱基处， 在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均导致翻译起始 效率不同程度的降低。 核糖体结合位点 核糖体结合位点对外源基因表达的影响 起始密码子及其后续若干密码子的影响 大肠杆菌中的起始tRNA 分子可以同时识别AUG、GUG 和UUG三种起始密码子，但其识别频率并不相同，通常 GUG为AUG的50%，而UUG只及AUG的25%。 除此之外，从AUG开始的前几个密码子碱基序列也至关 重要，至少这一序列不能与mRNA 的5‘端非编码区形成 茎环结构，否则便会严重干扰mRNA在核糖体上的准确 定位。 目前广泛用于外源基因表达的大肠杆菌表达型质粒上， 均含有与启动子来源相同的核糖体结合位点序列，序列 和间隔是最佳的。 核糖体结合位点 密码子 生物体对密码子的偏爱性 不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对 简并密码子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性，其 决定因素是： 生物基因组中的碱基含量 在富含AT的生物（如单链DNA噬菌体ΦX174）基因组中，密码子第三位上的U和A出现的频率较高；在GC丰 富的生物（如链霉菌）基因组中，第三位上含有G或C 的简并密码子占90%以上的绝对优势 密码子偏爱性对外源基因表达的影响 由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有较大程度的差异性，因此外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择。 一般而言，有两种策略可以使外源基因上的密码在大肠杆菌细胞中获得最佳表达： 外源