中药现代化之基因工程技术第二章1.ppt

* 2015/3/4 1 第二章 基因工程下游的重要步骤是表达后产物的分离、纯化、及基因工程产物的后处理工艺。 在表达产物的分泌机制的研究，分泌型载体受体系统的建立等方面，都有待于我们进一步深入研究和开发 * 2015/3/4 1 第二章 第二章 基因工程的原理 基因工程：也称基因操作、遗传工程，或重组体DNA技术。是指某个基因通过载体运送到另一种生物的活细胞内，使该细胞进行无性繁殖（克隆）及进行正常功能（表达），而创造出新的生物品种或新的遗传性状。 第一节 基因工程的概念 * 2015/3/4 1 第二章 具体操作：在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工合成的DNA片段）与载体系统（病毒、细菌质粒或噬菌体）的DNA结合，形成一个复制子。 * 5 第二章 第一节 基因工程的概念 这样形成的杂交分子可以在复制子所在的宿主细胞中复制，通过转化或转染宿主细胞、生长和筛选转化子，无性繁殖成克隆。而后直接利用转化子，或者将克隆的分子从转化子中分离出来后，再导入其他的表达体系，使重组基因在细胞内表达，最终产生特定基因产物 * 2015/3/4 1 第二章 第一节基因工程的概念 1971年，美国麻省理工学院就有人设想将猴肾病毒SV40的DNA与λ噬菌体DNA重组，然后导入大肠杆菌细胞内，此观点立即遭到许多科学家的反对，他们认为，这种带有病毒DNA的重组体分子有实验室逸出的可能，并且随着大肠杆菌感染到人类的肠道，其后果是不堪设想的 第二节 基因工程的安全性问题 * 6 第二章 植物基因工程方面，目前，人们已经可以按意愿培育作物新品种，此举有独特的技术优势和开发效益。但是也有可能对生物品种的多样性、病虫害抗性、环境生态平衡和产品安全性等方面带来潜在的或还没有预测到的不良影响 第二节 基因工程的安全性问题 * 7 第二章 在动物基因工程研究方面，科学家们利用高等细胞表达系统生产人用药品，安全性研究显得尤为突出 第二节 基因工程的安全性问题 * 2015/3/4 8 第二章 1 限制性内切酶 能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并在此处或附近将其切开的DNA核酸内切酶，也称限制酶 2 DNA聚合酶 3 DNA链接酶 第三节 各种工具酶 * 2015/3/4 1 第二章 目的基因：是指准备重组到受体细胞中进行表达的特定基因片段或DNA片段。 为了得到这段“外源基因”，我们采取分离、纯化、改造、扩增等步骤而获取目的基因 制备方法：物理法、化学合成法、鸟枪无性繁殖法、酶促逆转录合成法 第四节 制备目的基因的方法 * 2015/3/4 1 第二章 包括：密度梯度离心发，单链酶切发，分子杂交法 密度梯度离心法：由于核酸DNA双螺旋中碱基G与C配对，A与T配对，GC对较 集中的片段密度较大，采用精密度比较高的密度梯度离心方法可以将被切割成适当大小的DNA片段按密度大小不同分开。在通过与放射性标记的mRNA进行杂交来确定要分离的目的基因片段。 非洲爪蛙rDNA,5sDNA和海胆组蛋白基因就是采用这种方法分离得到的 1 物理化学法 * 2015/3/4 1 第二章 单链酶切法：碱基GC对之间有三个氢键，AT碱基对之间只有两个氢键，所以GC对较稳定。采用加热或变性剂处理DNA时，双链上AT配对较多的部位就先变性成单链，应用单链特异的S1核酸内切酶切除单链，再经过超速离心，分离出没有单链切口的DNA。最早海胆rDNA就是利用这种方法分离到的 1 物理化学法 * 2015/3/4 1 第二章 分子杂交法：单链DNA与其互补的碱基序列在适当的条件下，按“碱基互补配对”原则形成双链，这就是核酸分子杂交的原理。利用核酸分子间可以进行杂交的原理，非同源的DNA可以互补配对，DNA与RNA之间也可以配对，采用这种方法既能分离也能鉴定目的基因。果蝇18S、28SrDNA就是采用分子杂交的方法分离得到的 1 物理化学法 * 2015/3/4 1 第二章 主要包括 磷酸二酯法 磷酸三酯法 固相磷酸三酯法 2 化学合成法 * 2015/3/4 1 第二章 鸟枪法：一种基于基因组提取目的基因的方法。首先利用物理方法（机械剪切、超声波等）或酶切方法将生物细胞染色体的全部DNA切割成基因水平大小的片段，将这些片段与适当的载体结合成重组体，导入宿主细胞，构建成基因文库，之后再结合筛选方法，从众多转化细胞中选出含有目的基因的转化子，提取、分离、回收重组的DNA。 3 鸟枪无性繁殖法 * 2015/3/4 1 第二章 主要用于分子量较大而又不知道序列的基因 它以目的基因的mRNA为模板，由逆转录酶催化合成互补的cDNA。再在DNA聚合酶的作用下合成双链cDNA，与载体结合后转入受体菌，扩增为cDNA文库，再从文库中筛选出目的基因 4