基因工程课件-第二章 基因工程的主要技术原理.pptx

第二章 基因工程的主要技术原理DNA分子的切割与连接核酸分子杂交凝胶电泳细胞转化基因操作核酸序列分析基因的人工合成基因的定点突变PCR扩增等第一节 核酸的提取与纯化 核酸的提取和纯化是基因工程操作的最基本的技术。由于提取DNA的目的、种类、所用的生物、组织材料、实验条件等不同，DNA的提纯有很多方法。其中最常用的是碱抽提法。大肠杆菌基因组DNA 一、质粒DNA的提取质粒：是指存在于细菌、真菌等微生物细胞中、独立于染 色体外、能进行自我复制的遗传因子。 质粒通常是共价、闭合、环状双链DNA(covalent closed circular DNA，简称cccDNA)，分子大小范围从l kb左右到1000 kb。自20世纪80年代中期以来，在链霉菌、酵母、丝状真菌等微生物中都发现了线状DNA质粒，甚至还有RNA质粒。质粒对宿主细胞是非必需的，但在某些条件下，质粒能赋予宿主细胞以特殊的机能，从而使宿主得到生长的优势。如抗药性质粒和降解性质粒就能使宿主细胞在有相应药物或化学毒物的环境中生存。1.碱抽提法提取质粒DNA（1） 原理 在强碱性溶液中，DNA双链的氢键断裂变性，当溶液恢复中性时，DNA双链复性。 闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快；染色体线性DNA和有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质—SDS复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。（2） 所用的试剂作用① 溶菌酶属于糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的?-1，4糖苷键。在碱性条件（pH8）下有活性。②葡萄糖增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力的作用而降解（震荡）。③EDTAMg2+、Ca2+的螯合剂，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。④NaOH-SDSNaOH是强碱，提供pH12的碱性条件，使DNA双链变性。SDS是离子型表面活性剂，溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成“蛋白-SDS”复合物，使蛋白质（包括DNA酶）变性沉淀。⑤ NaAc-Hac缓冲液用冰醋酸把醋酸钠溶液的pH调到4.8，用来中和NaOH变性液，使DNA复性。高浓度的NaAc有利于变性的大分子（蛋白质、DNA、RNA等）沉淀。⑥ 乙醇用于沉淀DNA。DNA分子以水合状态“溶于”水里，乙醇能夺去DNA分子的水环境。一般使用2倍体积的无水乙醇（或0.6倍体积的异丙醇）。⑦ RNA酶A降解RNA。以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。⑧ TE缓冲液DNA保存液。由Tris-HCl和EDTA配制。EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解。⑨ 酚-氯仿蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。但苯酚会残留在DNA溶液中。（现已不用，多用各种商品化的层析柱纯化DNA)。（3）碱抽提法 质粒DNA提取的步骤 现在一般都使用大公司的成套试剂盒。试剂盒中的各种试剂成份都是按上述试剂和原理配制的。第一步：溶菌主要使用“溶液Ⅰ”溶解细菌细胞壁。溶液I 的配制： 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM EDTA，4-5mg/ml溶菌酶，RNaseA第二步：细菌细胞膜破坏，蛋白质和DNA变性。加入溶液II 使细菌细胞膜破坏，蛋白质和DNA变性。溶液II 的配制： 0.2N NaOH，1.0%SDS第三步：中和加入溶液III使DNA复性、并促使蛋白质-SDS复合物和染色体DNA、RNA沉淀。溶液III的配制： 3M 醋酸钠（用冰醋酸调pH至4.8）第四步：离心除去沉淀上清液中含有闭合质粒DNA。第五步：纯化DNA过柱或酚-氯仿抽提。第六步：沉淀DNA异丙醇或乙醇。2. 影响质粒DNA产量的因素质粒提取的实际产量虽然受提取过程中多方面的因素影响，但最重要的是菌株的遗传背景和质粒自身的拷贝数。（1）受体菌株一般要使用endA基因发生突变的大肠杆菌菌株。如DH5?、JM109、XL1-Blue等。 endA基因编码核酸内切酶Ⅰ，在Mg2+的存在下可将双链DNA消化成7bp的寡核苷酸片断。（2）质粒拷贝数这是直接决定DNA产量的重要因素之一。（3）质粒大小分子量大的质粒，拷贝数少。若干常用质粒的理论产量质粒名分子大小bp拷贝数质粒产量?g/mlpGEMpUCpBR322ColE1pACYCpSC101270027004400450040009000300-700500-7002515≈10≈61.8-4.12.9-4.10.320.15≈0.09≈0.12二、基因组DNA的提取从植物组织中制备 DNA用液氮冷冻后研磨成细粉末。（1）组织粉碎（2）细胞裂解用2%CTAB/2-ME(十六烷基三甲基溴化铵/2巯基乙醇）或1%十二烷基肌酸钠以及蛋白酶K。 65 oC温育。（3）纯化DNA用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白质污