氨基酸含量的测定-茚三酮比色法详解.ppt

实验九 氨基酸含量的测定（茚三酮比色法） 1. 实验原理 凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、氨基酸（脯氨酸除外）在碱性溶液中与水合茚三酮共热时，产生紫色化合物，最大吸收波长在570nm处，在一定浓度范围内，颜色深浅与氨基酸含量成正比，可用比色法进行测定。 2. 实验材料、仪器与试剂 材料：酱油 仪器：可见分光光度计，分析天平，容量瓶，移液管，具塞刻度试管。 试剂：茚三酮、氯化亚锡、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、标准氨基酸（异亮氨酸）。 3. 实验步骤 （2）标准曲线的绘制 4. 结果计算 6. 思考题 （1）茚三酮法测定氨基酸的原理是什么？ （2）试比较三种方法测定氨基酸含量的优缺点各是什么？ 氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤： （1）样品的处理：准确吸取0.5mL酱油于100mL烧杯中，加入5g活性炭和50mL蒸馏水，置于80℃水浴锅中，保持半小时后过滤，用蒸馏水将滤渣清洗数遍，收集滤液于100mL容量瓶中，定容至刻线，摇匀备用。 各种试剂加到比色管后混匀，于电炉上沸水浴15min，取出冷却至室温后加水至10mL刻度线，静置15min后，在570nm处测定吸光度，以氨基酸含量(μg)为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。 180 0.4 0.4 0.7 0.9 6 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 茚三酮/mL 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 磷酸盐缓冲液/mL 0.6 0.8 0.9 1.0 1.1 1.6 水/mL 200 160 140 120 100 0 氨基酸含量/μg 1.0 0.8 0.7 0.6 0.5 0 氨基酸标准溶液/mL 7 5 4 3 2 1 管号 按上表加样后混匀，按标准曲线的步骤进行实验，在相同条件下测定样品的吸光度，并在标准曲线上查出氨基酸含量微克数。 （3）样品测定 0.4 0.4 1.6 0 8 0.4 0.4 0.4 茚三酮/mL 0.4 0.4 0.4 磷酸盐缓冲液/mL 1.1 1.1 1.1 水/mL 0.5 0.5 0.5 样品溶液/mL 11 10 9 管号 5. 说明及注意事项 （1）该法是微量法，对氨基酸的最低检出量可达0.5μg，其其灵敏度高，重现性好。 （2）脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色，最大吸收波长在440nm处。 （3）通常采用的样品处理方法为：准确称取粉碎后的样品5g～10g或吸取液体样品5mL～10mL，置于烧杯中，加入50mL蒸馏水和5g左右的活性炭，加热煮沸，过滤。用30mL～40mL热水洗涤活性炭，收集滤液于100mL容量瓶中，加水至刻度线，摇匀备用。 * * * *