细胞工程_动物细胞工程.ppt

思考讨论：为什么细胞融合过程中使用的病毒需要灭活？不灭活行吗？ 因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂 质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合，不灭 活的话会感染细胞，而不能诱导细胞融合。 3、动物细胞融合技术的应用 细胞融合技术突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。 利用杂交瘤技术，制备单克隆抗体。 植物体细胞杂交 动物细胞融合 理论基础 融合前处理 诱导方法 结果 应用 相同点 制备单克隆抗体 培育新品种 杂交细胞 杂交植株 突破了远缘杂交不亲和的障碍，打破了生殖隔离 电激、振动、离心、聚乙二醇 纤维素酶、果胶酶 胰蛋白酶(或胶原蛋白酶） 细胞膜的流动性 细胞膜的流动性、细胞的全能性 电激、灭活的病毒、聚乙二醇 融合的原理相同，诱导方法相似 植物细胞杂交与动物细胞融合的比较 人们获得抗体的传统方法是? 将抗原注入动物体,然后从动物血清中提取抗体 这种方法的缺点是什么? 效率低，产量有限，纯度低，动物抗体注入人体可能产生严重的过敏反应。 能否用单个B淋巴细胞通过克隆形成的细胞群来产生单一类型的抗体呢？ B淋巴细胞在体外不能无限增殖。 二：动物细胞融合的成功应用 ——单克隆抗体的制备 思考 抗原 吞噬细胞摄取处理 T细胞 暴露、呈递 B细胞 直接刺激 浆细胞 增殖、分化 抗体 产生 从动物血清中分离 淋巴因子 获取抗体的传统方法 该方法的缺点是？ 传统获得抗体方法的缺点： 产量低，纯度低，特异性差 如何获得大量的、特异性强的抗体？ 利用动物细胞培养技术 克隆单一的经免疫的B细胞 这就是“单克隆抗体” 单克隆抗体的制备—极富创造性的方案 将能够产生特定抗体的B淋巴细胞和具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞融合在一起，形成杂交瘤细胞。杂交瘤细胞既能在体外快速生长，又能持续分泌成分单一的特异性抗体。这种单一类型的只针对某一特定抗原决定簇的抗体分子，就是单克隆抗体。 米尔斯坦(阿根廷)和科勒(德国)因此在1984年获诺贝尔奖。 1.如何取得B淋巴细胞？ 2.把B淋巴细胞与骨髓瘤细胞放在一起，有几种融合方式？ 3.如何筛选出所需的细胞? 4.细胞培养有几种方式? 5.如何提取单克隆抗体？ 制备过程提示: 制备单克隆抗体 2.单克隆抗体制备的原理 ◆每一个 只分泌一种特异性抗体。 ◆ 具有无限增殖的特性。 ◆ 技术将两种细胞融合获得杂交瘤细胞。杂交瘤细胞既能 ，又能产生足够数量的 。 ◆ 利用 技术大量培养杂交瘤细胞。 B淋巴细胞 骨髓瘤细胞 动物细胞融合 动物细胞培养 大量增殖 特定抗体 单克隆抗体制备过程 注射特定抗原 骨髓瘤细胞 在具有筛选作用的培养基上培养 体外培养 注射到小鼠腹腔 免疫的B淋巴细胞（浆细胞） 细胞培养 诱导融合 杂交瘤细胞 专一抗体检验 专一抗体检验阳性细胞 克隆细胞 单克隆抗体 第一次筛选 第二次筛选 B M M BM B M BB MM 筛选1 融合 体外培养 体内培养 注射入小鼠体内培养抗原 培养瓶中 筛选2 小鼠 动物细胞培养 骨髓瘤细胞 单克隆抗体 抗原 免疫处理 动物细胞融合 筛选 动物细胞培养 提取 例：已知细胞增殖时合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基喋呤阻断。 人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但一般不分裂增殖。 鼠骨髓瘤细胞中尽管没有S途径，但能不断分裂增殖， 将两种细胞在培养液中混合，加聚乙二醇促融，在培养液中有 种细胞。 加入氨基喋呤后，使D合成途径阻断，仅有D合成途径的 及其彼此融合的细胞不能增殖。 人淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂交细胞中可利用淋巴细胞中的S途径合成DNA而增殖。从培养液中分离出杂交细胞。 如何筛选出培养液中的杂交瘤细胞？ 5 骨髓瘤细胞 多孔细胞培养板 有限稀释法 将杂交瘤细胞稀释，用多孔细胞培养板培养，在每个孔只有一个杂交瘤细胞的情况下开始培养，然后再筛选出能产生特异性抗体的细胞群。 如何筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞？ 动物特异性免疫 分离B淋巴细胞（B）；找到骨髓瘤细胞（G）。注意B淋巴细胞是一个系列。（B1,B2,B3,---Bn） 细胞融合——三种融合方式:（BB;BG;GG） 第一次筛选：在“选择培养基培养”上培养筛选杂交瘤细胞（只有BG杂交瘤细胞存活。但BG杂交瘤细胞也是一个系列：如B1G,B2G---BnG。而BB,GG在此培养基上不能存活。） 第二次筛选：在“多孔培养板上”培养杂交瘤细胞系列 ，每孔只放一个杂交瘤细胞。“克隆化培养”每个杂交瘤细胞，并进行“单一抗体检测