细胞工程第4章 动物细胞工程细胞培养.ppt

鸡胚胎成纤维细胞的原代培养

1.取9日龄的鸡胚，用酒精消毒，在超净工作台内，小心取出鸡胚，放在培养皿中，除去头尾、四肢及内脏；2.胚体用含双抗PBS冲洗2~3次，切成1~2mm3的小块，然后转入容积适量大小的三角瓶内（或试管、烧杯）；3.按每个鸡胚加入约5mL的EDTA-胰酶消化液，在室温下消化10min；4.小牛血清终止消化，收集细胞悬液，没有消化完全的组织块可再消化一次；5.收集到的细胞悬液经100目过滤筛过滤，1000rpm离心5min，去上清；6.细胞沉淀用DMEM培养液重新悬浮，取出少量细胞悬液台盼蓝染色，计算细胞活力；7.以5×105个/mL的密度接种到培养瓶中（30mL细胞液/鸡胚），于38.5℃、5%CO2浓度、饱和湿度条件下培养。原代培养的注意事项：分离组织：使用锋利的刀具，减少对组织的损伤。在取材时除去脂肪和坏死组织。离心转速要适度。消化及接种：选取合适的消化酶，消化的时间因组织而异，一般为30min。接种的密度应比传代培养大——选择营养丰富的培养基和血清胚胎组织在原代培养中容易分离，细胞较易存活，增殖速度快，故比成年组织更可取。4.3.2传代培养当原代培养成功以后，随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一则细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。此时就需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养。这个过程就称为传代（passage）或者再培养（subculture）。对单层培养而言，80%汇合或刚汇合的细胞是较理想的传代阶段。

体外培养细胞的生长曲线二肽谷氨酰胺

（L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）在细胞培养液中频繁地补加谷氨酰胺，因而在培养操作过程中经常：

（1）频繁打开盖子，增加了破坏无菌状态的可能性；

（2）过多的追加L-谷氨酰胺，增加了培养基中氨的毒性水平。二肽谷氨酰胺

（L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）二肽谷氨酰胺在细胞培养中稳定而不降解,可高压灭菌,释放毒性氨最少!二肽谷氨酰胺在细胞内被氨肽酶所水解，产生L-谷氨酰胺和L-丙氨酸；因此在大部分细胞系统中二肽谷氨酰胺就可以象L-谷氨酰胺同样有效地被利用。二肽谷氨酰胺是最优替代物，它无需适应；既可用于贴壁细胞培养，也适合于悬浮细胞的培养。4.2.2培养基培养基细胞的生长需要一定的营养环境，用于维持细胞生长的营养基质称为培养基，即指所有用于各种目的的体外培养、保存细胞用的物质，就其本意上讲为人工模拟体内生长的营养环境，使细胞在此环境中有生长和繁殖的能力。它是提供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基础。细胞培养基的基本要求体外培养的细胞直接生活在培养基中，因此培养基应能满足细胞对营养成分、促生长因子、激素、渗透压、pH等诸多方面的要求。营养成分1.氨基酸

2.单糖：体外培养动物细胞时，几乎所有的培养基或培养液中都以葡萄糖作为必含的能源物质。

3.维生素

4.无机离子与微量元素促生长因子及激素各种激素、生长因子对于维持细胞的功能、保持细胞的状态（分化或未分化）具有十分重要的作用。有些激素对许多细胞生长有促生长作用，如胰岛素，它能促进细胞利用葡萄糖和氨基酸。有些激素对某一类细胞有明显促进作用，如氢化可的松可促进表皮细胞的生长，泌乳素有促进乳腺上皮细胞生长作用等。

气体与pH气体也是细胞生存的必需条件之一，所需气体主要是氧和二氧化碳。一般置细胞于95％空气加5％二氧化碳的混合气体环境中培养。动物细胞大多数需要轻微的碱性条件，pH值约在7.2-7.4pH在细胞生长过程中，随细胞数量的增多和代谢活动的加强，二氧化碳不断被释放，培养液变酸，PH值发生变化。由于NaHCO3容易分解为二氧化碳，很不稳定，致使缓冲系统难以精确地控制。故这一缓冲系统适合密闭培养。合成培养基中使用了NaHCO3-CO2缓冲系统，并采用开放培养，使细胞代谢产生的CO2及时溢出培养瓶，再通过稳定调节温箱中CO2浓度（5％），与培养基中的NaHCO3处于平衡状态。渗透压细胞必须生活在等渗环境中，大多数培养细胞对渗透压有一定耐受性。人血浆渗透压290mOsm/kg,可视为培养人体细胞的理想渗透压。鼠细胞渗透压在320mOsm/kg左右。对于大多数哺乳动物细胞，渗透压在260－320mOsm/kg的范围都适宜。无毒、无污染体外生长的细胞对微生物及一些有害有毒物质没有抵抗能力，因此培养基应达到无化学物质污染、无微生物污染（如细菌、真菌、支原体、病毒等）、无其他对细胞产生损伤作用的生物活性物质污染（如抗体、补体）。对于天然培养基，污染主要来源于