抗真菌药物敏感试验ppt课件.ppt

琼脂稀释法 培养基制备 RPMI 1640培养基: 2倍量:RPMI 1640 20.8g,葡萄糖40g, 以0.33M MOPS缓冲液溶解,调整pH值至6.9~7.1,过滤除菌,置-20℃保存。 HR培养基： 2倍量：29.3g HR培养基，NaHCO3 2.0g，溶于1000mL双蒸水中，调整pH值至7.5，过滤除菌，低温保存。 4％琼脂： 40g 琼脂，溶于1000mL蒸馏水中，高压灭菌15min，备用。 琼脂稀释法 菌液的制备 受试菌在SDA中35℃ 培养24小时（念珠菌属）或48小时（新生隐球菌） 取直径约5mm菌落，混悬于5mL灭菌的生理盐水中，涡旋混匀15秒，采用分光光度计在530nm处，调整菌悬液至0.5个麦氏单位浊度，相当于1×106～5×106/mL，作为菌液的工作液。 琼脂稀释法 药物平板的制备 将RPMI 1640培养基或HR培养基置60℃预温。 取4％琼脂，加热融化后，置60℃，保温。 将培养基和琼脂1:1混匀，分装入试管中，每管分装13.5mL，仍置60℃保温。 将不同浓度药液（工作液）1.5mL加入试管中，轻轻震摇混匀，倒入平皿，置水平桌面使之凝固，注意混匀时避免出现气泡。37℃， 15分钟，使干燥。 如采用平板多点接种，可将培养基18mL，加入不同浓度药液2mL，混匀倒入9cm直径平皿，制成药物平板备用。 琼脂稀释法 接种和培养 在药物平板中接种测试菌液，每点接种1～5μl，可进行多点接种。并设置生长对照平皿，空白对照平皿和标准菌株对照。 37℃ 培养48h或72h（新生隐球菌） 终点判定：确定生长对照菌生长良好，空白对照无污染菌生长。逐一观察从高浓度至低浓度平皿上的生长情况，以菌不生长平皿的药物浓度作为对该菌的MIC值。 琼脂扩散法 将待检菌掺入琼脂培养基内，将浸有固定浓度的抗真菌药液纸片置于琼脂培养基表面，经孵育后，根据纸片周围真菌生长被抑制的范围大小确定药物对真菌的抑制作用。如同时应用系列浓度纸片，尚可测出MIC值。 优点：简单、易行、不需复杂设备 缺点：单一浓度纸片仅能定性，不能确定MIC值。 药物纸片的标准化问题。 琼脂扩散法 培养基制备 基本培养基为MH琼脂，其中加入2%葡萄糖和亚甲基兰（0.5μg/mL）。调整pH值至7.2～7.4（室温下）。高压灭菌后分装入平皿，室温下冷却凝固后，37℃温箱中干燥10～30min，以去除平皿表面水蒸气。 培养基平皿可在2～8 ℃冰箱保存一周。如采用塑料袋包裹可适当延长。 使用前，应抽取同一批次平皿置于30～35℃孵箱中24小时，以确定无污染。 琼脂扩散法 药液纸片制备： 商品化药液纸片：应保存于－14℃以下冰箱中。使用前，应提前取出置于室温中平衡1～2小时。 琼脂扩散法 菌液制备 同试管稀释法，受试菌在SDA或PDA中35 ℃培养24小时（念珠菌属）。 取直径约5mm菌落，混悬于5mL灭菌的生理盐水中，涡旋混匀15秒，采用分光光度计在530nm处，调整菌悬液至0.5个浊度单位，相当于1×106～5×106/mL，作为菌液的贮备液。 琼脂扩散法 操作步骤： 用棉签蘸取菌液涂于平板上，重复三次，每次将平板旋转60o再进行涂布，最后涂布平板边缘。 将浸有药液的纸片贴于琼脂表面，可轻微加压保证纸片与琼脂贴合紧密。纸片与纸片中心距离一般大于24mm。通常，150mm平板纸片数量不超过12个；100mm平板不超过5个。由于药物扩散在接触时即已进行，因此，当纸片接触平板后即不可再移动。 将贴有纸片的平皿翻转后置35℃培养20～24小时，观察结果。如24小时菌生长不良，可将培养时间延长至48小时。 琼脂扩散法 结果判读 药物对受试菌有生长抑制时，可围绕纸片形成抑制环。以明显受抑制的环边缘作为边界，测量抑制环大小。环边缘针尖大小菌落或环内的大菌落可忽略不计。 琼脂扩散法 结果判定 质控菌株的参考值（mm） 白念珠菌（ATCC90028） 近平滑念珠菌（ATCC22019） 热带念珠菌（ATCC750) 克柔念珠菌（ATCC6258） 氟康唑（25μg） 28～39 22～33 26～37 伏力康唑（1μg） 31～42 28～37 16～25 琼脂扩散法 结果判定： 耐药 剂量依赖敏感 敏感 抑菌环直径 (mm) ≤14 15～18 ≥19 MIC值 (μg