《微生物学实验技术》课件.ppt

*************************************倾注平板法样品准备制备适当稀释度的微生物悬液接种培养基取0.1-1mL菌液加入无菌平皿倾注溶化琼脂加入45-50℃的溶化培养基15-20mL混匀培养轻轻摇动平皿混匀，凝固后倒置培养倾注平板法是将微生物与液态培养基混合后凝固成平板的技术，也称混菌平板法。这种方法可以准确控制接种量，适合用于微生物计数和特殊培养要求。与涂布平板相比，倾注平板中的菌落分布于培养基内部而非表面，有利于兼性厌氧菌和微需氧菌的生长。操作倾注平板法时，培养基温度控制是关键。温度过高会杀死微生物，过低则会导致培养基过早凝固难以混匀。倾注前应先在平皿中加入菌液，再倾入培养基，这样可以避免高温对微生物的损伤。倾注后应立即进行混匀，通常采用8字或圆周运动方式轻轻摇动平皿，避免形成气泡。培养基凝固后应倒置培养，防止凝结水滴落污染菌落。涂布平板法准备工作将无菌涂布棒浸入75%酒精中，火焰灭菌后冷却；制备适当稀释度的菌液加样吸取0.1-0.2mL菌液滴于固体培养基中央涂布操作用灭菌涂布棒在平板表面均匀涂抹，边旋转平板边涂布，使菌液均匀分布培养观察涂布完成后倒置平板，置于适宜温度培养，观察菌落生长情况涂布平板法是将微生物悬液直接涂抹在固体培养基表面的技术，适用于需要观察表面菌落形态特征的实验。与划线法不同，涂布法主要用于定量接种，如微生物计数、抗生素敏感性测定等。涂布操作应迅速完成，避免培养基表面干燥。涂布工具通常有玻璃涂布棒、一次性塑料涂布棒和接种环等。玻璃涂布棒可反复使用，经济实惠；一次性塑料涂布棒方便卫生；接种环则适合小体积涂布。涂布时应轻柔操作，避免划破培养基。如使用涂布器时，应与平板保持30-40°角，均匀旋转平板，使菌液分布均匀。涂布后应立即盖上平板盖，避免污染。液体培养物的接种液体培养物的接种是将微生物转移到液体培养基中进行培养的技术。液体培养常用于微生物的增殖培养、发酵生产和生理生化特性研究。常用的液体培养容器包括试管、三角瓶、摇瓶和发酵罐等。接种方法根据容器类型和实验目的而异，主要包括直接接种法、预培养接种法和定量接种法。接种液体培养基时，应注意几个关键点：首先，接种量一般控制在培养基体积的1-5%，过多或过少都会影响微生物的生长；其次，接种前应摇匀菌液，确保微生物分布均匀；第三，接种过程中应保持无菌操作，防止污染；最后，接种完成后应立即进行混匀，对于需氧微生物，培养基体积一般不超过容器容积的1/3至1/2，以确保充分通气。根据微生物生长特性，选择适当的培养方式，如静置培养、振荡培养或通气培养等。厌氧培养技术直接无氧法完全隔绝空气的培养方式气体置换法用厌氧气体替代培养环境中的空气化学吸氧法使用化学试剂消除环境中的氧气4特种培养基法在培养基中添加还原剂降低氧化还原电位厌氧培养技术是培养严格厌氧菌必不可少的专门技术。厌氧菌因缺乏过氧化氢酶和超氧化物歧化酶等保护酶系统，在有氧环境中会迅速死亡。常用的厌氧培养方法包括厌氧罐法、厌氧培养箱法、厌氧工作站法和厌氧指示管法等。厌氧培养的关键在于创建和维持无氧环境。厌氧指示剂（如亚甲蓝、甲次蓝等）可用于监测厌氧状态，在无氧条件下变为无色。厌氧培养基中常添加还原剂如硫代硫酸钠、L-半胱氨酸、抗坏血酸等，以降低氧化还原电位。此外，厌氧菌接种时应避免长时间暴露在空气中，接种后应立即放入厌氧环境中培养。厌氧培养技术在医学微生物学、环境微生物学和工业微生物学中有广泛应用。微生物的分离方法物理分离法平板划线法：逐步稀释分离单菌落倾注平板法：菌体分散于琼脂中涂布平板法：均匀分布于平板表面稀释分离法：系列稀释后接种生理生化分离法选择培养基法：利用特殊营养需求抑制剂添加法：抑制特定微生物差异培养法：利用生长速度差异特殊条件法：温度、pH、盐度等其他特殊方法微操作法：显微镜下直接分离梯度板法：利用梯度培养基色谱分离法：利用色谱技术空气滴法：稀释度高的分离技术微生物分离是从混合群体中获取纯培养物的过程，是微生物学研究的基础。自然界中的微生物几乎都以混合状态存在，分离纯化是研究特定微生物特性的前提。分离方法的选择应根据目标微生物的特性和混合物的复杂程度确定，常需结合多种方法才能获得满意效果。有效的分离策略通常分为富集和分离两个阶段。富集培养针对目标微生物创造选择性生长条件，使其在混合物中占优势；分离则通过物理方法获得单菌种纯培养物。此外，新型分离技术如流式细胞分选、激光捕获显微切割等也逐渐应用于特殊微生物的分离，极大拓展了微生物分离的能力范围。稀释平板法稀释平板法是微生物分离和计数的基础方法