《基因工程的载体》课件.ppt

*************************************限制性内切酶发现与来源限制性内切酶（简称限制酶）最初发现于细菌，是细菌防御外来DNA的天然防御系统。它们能识别并切割特定的DNA序列，通常是4-8个碱基对的特定序列。目前已发现几千种限制酶，来源于不同的细菌菌株，为分子生物学研究提供了丰富的工具。分类限制酶按照识别位点、切割位置和辅因子需求等特性分为I型、II型、III型和IV型。其中II型限制酶最为常用，它们在识别序列内部或附近直接切割DNA。II型限制酶又可细分为多种亚型，如产生粘性末端的传统II型酶和产生平端的IIP型酶等。命名规则限制酶的命名遵循特定规则：首字母表示细菌属，第二、三字母表示菌种，后续字母表示菌株，罗马数字表示从该菌株分离的顺序。例如，EcoRI来自大肠杆菌(Escherichiacoli)RY13菌株的第一种限制酶。不同限制酶识别不同的序列，为DNA操作提供了多样选择。常用限制性内切酶酶名识别序列切割位点特点与应用EcoRIG↓AATTC产生5突出端经典常用酶，切割效率高BamHIG↓GATCC产生5突出端常用于构建基因文库HindIIIA↓AGCTT产生5突出端多克隆位点常见酶NotIGC↓GGCCGC产生5突出端8bp识别序列，切割频率低SmaICCC↓GGG产生平端适用于平端连接PstICTGCA↓G产生3突出端产生3突出端的少数酶之一选择适当的限制酶是载体构建的关键步骤。在设计克隆策略时，需要考虑多种因素：首先，确保所选酶的识别位点存在于载体的多克隆位点中，但不存在于目的基因片段内部；其次，考虑不同酶的切割效率、反应条件的兼容性和产生末端的类型。许多限制酶具有明显的「星状活性」（非特异性切割），特别是在非最适条件下（如酶浓度过高、甘油浓度高或非标准缓冲液）。因此在实际操作中，需严格控制反应条件，必要时选择高保真版本的限制酶。双酶切策略（使用两种产生不兼容粘性末端的酶）可以提高克隆的定向性和效率。DNA连接酶结构与功能DNA连接酶能催化DNA分子间磷酸二酯键的形成1T4DNA连接酶最常用连接酶，能连接平端和粘性末端2E.coliDNA连接酶主要连接粘性末端，需NAD+作辅因子3反应条件优化温度、时间、DNA浓度和载体:插入片段比例4DNA连接酶是构建重组DNA分子的关键酶类，能催化DNA片段间磷酸二酯键的形成。T4DNA连接酶源自T4噬菌体，是分子克隆中最常用的连接酶，它能连接平端和粘性末端DNA，使用ATP作为辅因子。大肠杆菌DNA连接酶主要用于连接粘性末端，效率较T4连接酶低，使用NAD+作为辅因子。连接反应的效率受多种因素影响：DNA末端浓度、载体与插入片段的比例、温度和反应时间等。对于粘性末端连接，通常在室温或16°C进行；对于效率较低的平端连接，可采用降温连接策略（先在较高温度如22°C退火，再在较低温度如4-16°C连接）或添加PEG等添加剂增强效率。载体:插入片段的摩尔比一般建议为1:3至1:5。同源重组技术基本原理同源重组技术利用DNA分子间的序列同源性进行重组，无需传统的限制酶切和连接。该技术基于细胞内天然的DNA修复和重组机制，要求参与重组的DNA片段末端具有相同或相似的序列（通常15-50bp）。通过PCR设计带有同源臂的引物，可以方便地为目标片段添加所需的同源序列。体内同源重组体内同源重组利用宿主细胞（如酵母）的重组机制实现DNA片段整合。这种方法简单直接，无需体外操作，特别适合酵母等重组效率高的宿主。常用策略包括末端同源重组和全长同源重组。这种方法在酵母双杂交系统构建和酵母表达载体改造中应用广泛。体外同源重组体外同源重组使用特殊酶系在试管中完成重组过程，如Gibson装配法、In-Fusion克隆和SequenceandLigationIndependentCloning(SLIC)等。这些方法能高效实现多片段的精确无缝连接，克服了传统克隆中限制位点限制和连接效率低等问题，已成为现代合成生物学中构建复杂载体的首选方法。Gibson装配法1基本原理Gibson装配法（GibsonAssembly）是一种快速、高效的DNA片段连接方法，由DanielGibson博士于2009年开发。该方法利用三种酶的协同作用，在等温条件下（通常50°C）一步完成多个DNA片段的无缝连接。这三种酶分别是5外切酶（创造单链突出端）、DNA聚合酶（填充缺口）和DNA连接酶（连接缺口）。2操作步骤Gibson装配法要求连接的DNA片段间具有20-40bp