基因工程-基因工程载体.ppt

苏州科技学院生物系 叶亚新 第三章 基因工程的载体 载体：携带外源基因进入受体细胞的工具 用于基因工程的载体 第三章 基因工程的载体 作为基因工程载体的基本功能 1. 运送外源基因高效转入受体细胞 2. 为外源基因提供复制能力或整合能力 3. 为外源基因的扩增或表达提供条件 第三章 基因工程的载体 作为基因工程载体必须具备的基本条件 1. 具有对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性） 2. 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点 3. 长度尽可能小，以提高其载装能力 4. 具有多种单一的酶切位点 5. 具有合适的选择性标记 第一节 E.coli 质粒载体 一、质粒（plasmid）的一般性质 1、定义 质粒是存在于细菌细胞质中独立于染色体而自主复制的共价、封闭、环状双链DNA分子（Covalently closed Circular DNA, ccc DNA） 第一节 E.coli 质粒载体 一、质粒（plasmid）的一般性质 2、特征 自主复制性 质粒DNA携带有自己的复制起始区（ori）以及一个控制质粒拷贝数的基因，因此它能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制 第一节 E.coli 质粒载体 一、质粒（plasmid）的一般性质 2、特征 不相容性 利用同一复制系统的不同质粒（RNAI RNAII Rop因子）如果被导入同一细胞中，它们在复制及随后分配到子细胞的过程中，就会彼此竞争 ，几种质粒中只能有一种长期稳定地留在细胞中，这就是所谓的质粒不相容性。 第一节 E.coli 质粒载体 一、质粒（plasmid）的一般性质 2、特征 可扩增性 pMB1或ColEI类质粒在蛋白质合成中断时，质粒复制能持续合成，这样当用氯霉素抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制时，带有pMB1或ColEI复制子的质粒将利用丰富的原料大量复制，最后每个细胞可以积聚2000-3000个拷贝，这叫做氯霉素扩增。 第一节 E.coli 质粒载体 一、质粒（plasmid）的一般性质 2、特征 携带遗传标记 在实验室中将质粒通过物理方法导入受体细胞，但是即使在最佳条件下，受体细胞中也只有少数细胞能稳定地接受质粒，要想找到这些进入了质粒的受体细胞，就要利用载体质粒上的遗传标记，天然质粒上碰巧携带许多功能基因，它们便可被用作选择标记。 第一节 E.coli 质粒载体 一、质粒（plasmid）的一般性质 3、分类 接合型和非接合型 严紧性和松弛型 在基因工程中使用的质粒都是松弛型质粒 第一节 E.coli 质粒载体 二、质粒（plasmid）载体的构建 1、理想质粒载体所具备的条件 质粒较小 质粒带有可供选择的标记 带有尽可能多的单一限制酶切位点 应有较高的基因表达能力 第一节 E.coli 质粒载体 二、质粒（plasmid）载体的构建 2、质粒人工构建的目的 ? 天然质粒往往存在着这样或那样的缺陷，因而不适合用作基因工程的载体必须对之进行改造构建： （1）加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择? （2）增加或减少合适的酶切位点，便于重组? （3）缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量? （4）改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝? （5）根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件 方法就是重组，拼拼接接，挖肉补疮。 多拷贝质粒 经过人工突变，除去控制拷贝数负调节基因，使质粒拷贝数达到每个细胞数千，用于扩增外源基因。? 测序质粒 拷贝数高，加装测定顺序所必需的序列，如多切口接头，便于各种片段方便克隆? 整合质粒 装有整合促进基因及整合特异序列，便于外源基因准确重组整合入受体细胞的染色体上? 穿梭质粒 含有两个不同的复制子，能在两种不同的受体细胞中复制? 表达质粒 装有强的启动基因，合适的顺序以及有效的终止子，以便任何外源基因在受体细胞内的高效表达? 探针质粒 筛选克隆或寻找基因元件，他通常装有一个可以定量测定其表达的标记基因，如抗性基因。筛选启动基因、终止子等。 第一节 E.coli 质粒载体 二、质粒（plasmid）载体的构建 3、人工组建克隆载体-pBR322 大小：4.3 kb 选择标记：Apr Tcr 单一酶切位点：EcoRⅠ HindⅢ BamHⅠ PstⅠI SalⅠ 等 第一节 E.coli 质粒载体 二、质粒（plasmid）载体的构建 3、人工组建克隆载体-pBR322 用于组建pBR322的三个亲本质粒的特征： pSE2124：Apr基因 pMB8 :Col EI松弛型复制子 pSC101:Tcr基因 第一节 E.coli 质