三、基因工程的载体.ppt

第三章：基因工程的载体 用于基因克隆的载体 报告基因：载体上导入，证明载体已经转入宿主细胞中，将含有目的基因的宿主从其它细胞中区分出来，比如抗药性报告基因，LacZ，lux等 蓝白斑筛选：利用β-半乳糖苷酶插入失活的载体，在生色底物(X-gal)和诱导物(1PTG)存在时，可形成深蓝色菌斑。用这种载体进行克隆时，β-半乳糖苷酶基因的大部分被外源DNA片段取代，所产生的重组体丧失α-互补能力，在含有X-gal和IPTG的平板下形成无色菌斑。因此，对于这类重组载体，可通过组织化学方法进行重组子的筛选。 用于基因转移的受体菌或细胞 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体DNA l-DNA载体的构建：删除重复的酶切位点 野生型的l-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不 利于重组操作，必须删除至1 - 2个 同时，为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增加一 些单一的酶切位点 除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增添酶 位点 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体DNA l-DNA载体的构建：加装选择标记 与质粒不同，野生型l-DNA上缺少合适的选择标记，因此 加装选择标记是l-DNA克隆载体构建的重要内容 l-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类： 免疫功能类标记 颜色反应类标记 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体DNA l-DNA载体的构建：加装选择标记 imm434 imm434基因编码一种阻止l-噬菌体 进入溶菌循环的阻遏物。含有完整标记 基因的l-载体进入受体细胞后，建立溶 原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑； 当外源DNA插入到标记基因中，基因灭 活， l-重组分子便进入溶菌循环，形成 透明斑 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体DNA l-DNA载体的构建：加装选择标记 lacZ lacZ基因编码b-半乳糖苷酶，能催化 无色的X-gal生成蓝色化合物。当外源基 因插入到lacZ基因中，基因灭活，不能 合成蓝色化合物；而空载体l-DNA则产 生蓝色透明斑 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体DNA l-DNA载体的构建：构建琥珀密码子的突变体 琥珀型突变（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突变。大肠杆菌的某些菌株含有特异性的校正基因，其编码产物校正tRNA能专一性地纠正这一突变。 将野生型l-DNA上D和E两个头部包装蛋白的基因中的CAG密码子突变成UAG。当这种l-DNA进入一般的大肠杆菌菌株后，不能合成有活性的头部蛋白，也就不能被包装和裂解细菌，这样就可以阻止有害重组体的生物污染及扩散，而基因工程实验中使用的受体则是具有琥珀型突变体校正功能的菌株。 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体DNA l-DNA重组分子的体外包装： l-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞 用于体外包装的蛋白质可直接从感染了l噬菌体的大肠杆菌中提取，现已商品化。这些包装蛋白通常分为相互互补的两部分：一部分缺少E组份，另一部分则缺少D组份。包装时，当且仅当这两部分包装蛋白与重组l-DNA分子混合后，包装才能有效进行，任何一种蛋白包装液被重组l-DNA污染后，均不能被包装成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体DNA l-DNA及其重组分子的分离纯化： 将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期 加入l噬菌体或重组l噬菌体的悬浮液，37℃培养1小时 用新鲜培养基稀释，继续培养4 -12小时。这时噬菌体颗粒 密度已达1013 -1014 / L，大肠杆菌细胞已完全裂解 超速离心，沉淀噬菌体 苯酚抽提，释放l-DNA 乙醇或异丙醇沉淀l-DNA 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体DNA l-DNA作为载体的优点： l-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌 l-DNA载体的装载能力为25 kb，远远大于质粒的装载量 重组l-DNA分子的筛选较为方便 重组l-DNA分子的提取较为简便 l-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达 外源基因 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的M13单链噬菌体DNA M13噬菌体的生物学特性： 生物结构 M13噬菌体的外型呈丝状 M13 噬菌体由外壳包装蛋白和正链DNA组成 M13 DNA全长6407个核苷酸 M13 DNA上至少有10个基因 2700个外壳蛋白分子 M13 噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的M13单链噬菌体DNA M13噬菌体的生物学特性： 感染周期 + DNA （+）DNA RFDNA RFDNA RFDNA -