基因工程载体.ppt

基因工程载体 1. 载体 （Vectors） 3. 基因工程对载体的要求 4. 载体 的种类 第一节 质粒载体 大肠杆菌的质粒 2 质粒的空间构型： ② 开环DNA（ open circular， ocDNA） 3 质粒空间构型与电泳速率 1 质粒的可转移性 （1） 接合型质粒： （2） 非接合型质粒： ? Col质粒： 四、质粒载体的构建 （2）筛选标志不理想 ColE1 2. 质粒载体必须具备的基本条件 4. 质粒的选择标记及原理 ② 遗传标记 （2）抗菌素选择原理 （2）低拷贝数的质粒载体 （3）复制失控的质粒载体 （4） 插入失活型质粒载体 （5）正选择的质粒载体 （6） 表达型质粒载体 ① 表达载体的结构 五、经典的大肠杆菌质粒载体 （4）克隆位点 2. ColE1 （4）克隆位点 （5）ColE1的选择缺陷 3. pBR322： （5）pBR322的优点 ③ 高拷贝数 （6）pBR322的缺点 （7）pBR322的改进 ② 改造EcoR I 位点 4. pUC系列 （1）元件来源 pUC18/19 （4）选择标记 ② ?-半乳糖苷酶X-gal显色反应： ③ lacZ的?肽互补 2）受体菌lacZ突变（lacZ?M15） 3）载体lacZ’与?互补 4）?互补的插入失活 ④ IPTG的诱导作用 IPTG诱导的结果： （5）pUC系列载体的优点 六、其它质粒载体 （1）pGEM-3Z的特点： 3. 穿梭质粒载体 （2）常用的穿梭质粒载体 （3）穿梭载体的优点 七、质粒载体的不稳定性 2. 质粒分配方式 （2）随机分配 3. 分离的不稳定性 4. 结构的不稳定性 5. 影响质粒载体稳定性的主要因素 （2）质粒载体的拷贝数 （3）寄主菌的重组体系 T4 Bacteriophage 二、噬菌体的生活周期 2. 溶源周期： 三、单链噬菌体载体 1. 单链DNA噬菌体的特点 2. M13 噬菌体 3. M13载体的构建： （2）加入酶切位点 4. M13系列载体的优点 5. M13载体的缺点 6. 噬菌粒载体（phagemid vectors） （1）噬菌粒载体的特点 （2）pUC118/pUC119 pUC118/119 （3）PCR产物克隆载体 T 载体 pCR2.1 pCR2.1的MCS Promega 公司的T载体系列 T vector的克隆过程——简便！ 四、双链噬菌体载体—?载体 2. ?噬菌体的基因组特点 3. ?噬菌体载体的构建 2. 染色体复制和遗传的三个基本组件： 3. YAC的组成结构 （2）端粒（TEL） （4）克隆位点 （5）在酵母中的标记基因 4. YAC克隆外源DNA 5. YAC转化过程 感染细菌后，将自己的DNA整合到细菌的染色体DNA中，成为它的一个组成部分。形成这一过程称为溶源化（lysogenization)。 整合到细菌染色体的噬菌体DNA称为原噬菌体，随细菌的染色体复制而复制。 温和噬菌体（temperate phage) 原噬菌体（prophage)： M13、f1、fd 噬菌体 单链环状DNA的丝状大肠杆菌噬菌体： M13 噬菌体 （2）复制型（RF）是双链环状DNA。 （3）RF DNA和ssDNA都能转染感受态 大肠杆菌。并产生噬菌斑。 （5）可产生大量的含有外源DNA插入片 断的单链分子，便于作探针或测序。 （1）+DNA。（ssDNA） （4）不存在包装限制。 RF dsDNA在寄主细胞内以高拷贝形式存在。 成熟的噬菌体里只包装有 + DNA，也容易提取。 M13噬菌体只感染雄性大肠杆菌。 但M13 DNA可以转染雌性大肠杆菌。 6407 bp。 （2）DNA长度 （3）DNA提纯 （1）寄主 M13基因组中只有基因II与基因IV之间存在一段507bp的基因间隔区。 （1）克隆区域的选定 ① 基因间隔区（intergenic region, IG区） IG区内只有一个 BsuI 切点。 其余9个BsuI限制性位点分布在其它部位。 ② 酶切位点 在IG区内插入一个大肠杆菌的LacZ’（?-肽序列)。 利用?-肽序列中的三个单一酶切位点（Bgl II、Ava II 和 Pvu I）。 ① 在IG区内加入单一内切酶位点 第一个M13载体：M13mp1： M13 RF BsuI不完全消化 各种长度的线性片断 （其中应有只在IG上切开的线性全长M13） E.coli lac基因的HindII片断(lacI、lacP、lacO、lacZ’） 连接 M13mp1 JM101宿主 只有在IG区插入lacZ’才能存活并在Xgal上出现互补的蓝噬菌斑 在M13mp1的LacZ’的5‘端加上一段人工合成的多克隆位点