实验4_叶绿素的提取理化性质和含量测定.ppt

实验四 叶绿素的提取、理化性质和含量测定 （p130－136） 一、叶绿素的提取 二、叶绿素的理化性质 三、叶绿素含量的测定 1. 实验目的 1）掌握叶绿素的提取及其含量测定的方法 2）了解叶绿素的理化性质 2. 实验原理 2.1 用含水的有机溶剂提取叶绿素 2.2 叶绿素的物理性质 吸收光谱 荧光现象 2.3 叶绿素的化学性质 取代反应 皂化反应 2.1 用含水的有机溶剂提取叶绿素 亲水的卟啉环的“头部”: 镁原子居于卟啉环的中央，带正电性，与其相联的氮原子则偏向于带负电性，因而卟啉具有极性，是亲水的，可以与蛋白质结合。 亲脂的叶绿醇的“尾巴”: 叶醇是由四个异戊二烯单位组成的双萜，是一个亲脂的脂肪链，它决定了叶绿素的脂溶性。 2.2 叶绿素的物理性质 2.2.1 吸收光谱 2.2.2 荧光现象 2.2.3 含量测定 2.2.3 含量测定 叶绿素a、b在红光区的最大吸收峰分别位于663 nm 和645 nm； 叶绿素a、b在652 nm处有相同的比吸收系数（34.5），测OD652求出叶绿素a、b总量。 故叶绿素浓度 C＝OD652 / 34.5 ( mg/ml ) 叶绿素的含量（mg/g）= [叶绿素的浓度×提取液体积×稀释倍数]/样品鲜重 2.3 叶绿素的化学性质 2.3.1 叶绿素的结构 2.3.2 取代反应 2.3.3 皂化反应 2.3.1 叶绿素的结构 叶绿素a与b很相似，不同之处仅在于Chla第二个吡咯环上的一个甲基(-CH3)被醛基(-CHO)所取代即Chlb。???? 2.3.2 取代反应 2.3.2.1 稀酸 去镁 铜代 2.3.2.2 浓酸 去镁 水解 2.3.2.1 稀酸 叶绿素溶液与稀酸(如:草酸)作用，H+取代Mg后的产物为褐色的去镁叶绿素； 去镁叶绿素与Cu2+ 或Zn2+作用， Cu2+ 等离子取代后的产物为深绿色的铜代叶绿素等； 2.3.2.2 浓酸 叶绿素溶液与浓酸(如:盐酸)作用，除了代换Mg外，可使去镁叶绿素迅速分解出叶绿醇，并形成褐绿色的去镁叶绿酸。 2.3.3 皂化反应 叶绿酸是二羧酸，其中一个羧基被甲醇酯化，另一个被叶绿醇酯化。叶绿素是叶绿酸的酯，能发生皂化反应。 叶绿素与碱皂化形成的叶绿素盐能溶于水，极性增大。 皂化分层 叶绿素的盐形成以后，因分子极性增大，易溶于稀酒精溶液中，不能进入苯层； 而类胡萝卜素在苯中的溶解度大于在醇溶液中 一部分苯分散在水中形成乳胶体，出现一层乳白色的溶液 低温下发生皂化反应的叶绿体色素溶液，易乳化而出现白色絮状物，溶液浑浊，且不分层。 3 材料、试剂与配备 1 材料 菠菜叶片 2 仪器设备 研钵，漏斗，剪刀，试管，试管夹，容量瓶(25ml,50ml)，分光光度计，水浴锅等 3 试剂 95%乙醇，苯，浓盐酸，36%乙酸， CuSO4， MgCO3，石英砂 叶绿体色素提取 称取新鲜去大叶脉的菠菜叶片3g，剪碎放入研钵中， 加少量石英砂和碳酸镁及5ml 95％乙醇，研成均浆，过滤入25ml 容量瓶，分别用5ml 95％乙醇冲洗研钵3次，冲洗液同样过滤，收集滤液，倒入容量瓶中，最后用95％乙醇定容至25ml，放入暗处备用。 2. 叶绿素的荧光现象 取叶绿素提取液2ml放入试管中，在直射光下观察溶液的透射光及反射光的颜色有何不同？ 3. 光对叶绿体色素的破坏作用 取两支试管，各加入叶绿体色素提取液2ml，一管放在直射光下，另一管放在黑暗处，1～2 h后观察两管溶液颜色有何变化？ 6. 叶绿体色素含量测定 吸取叶绿体色素提取液5ml，用95%乙醇定容至50ml。以95%乙醇为空白对照，在波长652nm下测定吸光度，并计算总叶绿素的浓度。 最后，根据下式可进一步求出植物组织中叶绿素的含量： 叶绿素的含量（mg/g）= [叶绿素的浓度×稀释倍数×提取液体积] /样品鲜重 * * 2.2.1 叶绿素的吸收光谱 红光区：640~660 nm 篮紫光区：430~450 nm 胡萝卜素和叶黄素：400~500 nm 不用蓝光区测叶绿素含量。 2.2.2 荧光现象 透射光下 反射光下 叶绿素溶液在透射光下呈绿色，在反射光下呈红色的现象。 分子吸收的光能有一部分消耗于分子内部的振动上，发射的荧光的波长总是比被吸收光的波长要长 叶绿素吸收红光后处于第一单线态，叶绿素分子要从第一单线态返回基态所发射的光称为荧光。 卟啉环中的Mg处于不稳定的状态，可被H+、Cu2+ 、Zn2+等离子取代。 叶绿素→去镁叶绿素→铜代叶绿素（稳定而不易降解，常