实验4叶绿素的提取、理化性质和含量测定.ppt

2017实验的取材012018操作及观察022019实验数据的处理032020实验结果的分析：分清错误和误差042021思考题052022实验报告06实验中的注意事项：实验四叶绿素的提取、理化性质和含量测定（p130－136）一、叶绿素的提取二、叶绿素的理化性质三、叶绿素含量的测定1.实验目的1）掌握叶绿素的提取及其含量测定的方法2）了解叶绿素的理化性质2.实验原理2.1用含水的有机溶剂提取叶绿素2.2叶绿素的物理性质吸收光谱荧光现象2.3叶绿素的化学性质取代反应皂化反应2.1用含水的有机溶剂提取叶绿素镁原子居于卟啉环的中央，带正电性，与其相联的氮原子则偏向于带负电性，因而卟啉具有极性，是亲水的，可以与蛋白质结合。亲水的卟啉环的“头部”:叶醇是由四个异戊二烯单位组成的双萜，是一个亲脂的脂肪链，它决定了叶绿素的脂溶性。亲脂的叶绿醇的“尾巴”:01吸收光谱02荧光现象03含量测定2.2叶绿素的物理性质2.2.1叶绿素的吸收光谱2.2.2荧光现象透射光下反射光下叶绿体吸收光后，激发了捕光色素蛋白复合体（LHC），LHC将其能量传递到PSII或PSI。其间所吸收的光能有所损失，大约3%-9%的所吸收的光能被重新发射出来，其波长较长,也即叶绿素荧光。叶绿素溶液在透射光下呈绿色，在反射光下呈红色的现象。叶绿素吸收红光后处于第一单线态，叶绿素分子要从第一单线态返回基态所发射的光称为荧光。分子吸收的光能有一部分消耗于分子内部的振动上，发射的荧光的波长总是比被吸收光的波长要长叶绿素a、b在652nm处有相同的比吸收系数（34.5），测OD652求出叶绿素a、b总量。故叶绿素浓度C＝OD652/34.5(mg/ml)叶绿素的含量（mg/g）=[叶绿素的浓度×提取液体积×稀释倍数]/样品鲜重叶绿素a、b在红光区的最大吸收峰分别位于663nm和645nm；2.2.3含量测定叶绿素的结构取代反应皂化反应2.3叶绿素的化学性质2.3.1叶绿素的结构叶绿素a与b很相似，不同之处仅在于Chla第二个吡咯环上的一个甲基(-CH3)被醛基(-CHO)所取代即Chlb。????2.3.2取代反应去镁水解卟啉环中的Mg处于不稳定的状态，可被H+、Cu2+、Zn2+等离子取代。浓酸稀酸去镁铜代叶绿素溶液与稀酸(如:草酸)作用，H+取代Mg后的产物为褐色的去镁叶绿素；去镁叶绿素与Cu2+或Zn2+作用，Cu2+等离子取代后的产物为深绿色的铜代叶绿素等；稀酸1浓酸叶绿素溶液与浓酸(如:盐酸)作用，除了代换Mg外，可使去镁叶绿素迅速分解出叶绿醇，并形成褐绿色的去镁叶绿酸。2叶绿素→去镁叶绿素→铜代叶绿素（稳定而不易降解，常用醋酸铜处理来保存绿色植物标本）2.3.3皂化反应叶绿素与碱皂化形成的叶绿素盐能溶于水，极性增大。叶绿酸是二羧酸，其中一个羧基被甲醇酯化，另一个被叶绿醇酯化。叶绿素是叶绿酸的酯，能发生皂化反应。皂化分层叶绿素的盐形成以后，因分子极性增大，易溶于稀酒精溶液中，不能进入苯层；而类胡萝卜素在苯中的溶解度大于在醇溶液中一部分苯分散在水中形成乳胶体，出现一层乳白色的溶液低温下发生皂化反应的叶绿体色素溶液，易乳化而出现白色絮状物，溶液浑浊，且不分层。3材料、试剂与配备材料菠菜叶片仪器设备研钵，漏斗，剪刀，试管，试管夹，容量瓶(25ml,50ml)，分光光度计，水浴锅等试剂95%乙醇，苯，浓盐酸，36%乙酸，CuSO4，MgCO3，石英砂叶绿素的提取叶绿素的物理性质透射光颜色反射光颜色叶绿素含量的测定叶绿素的化学性质取代反应皂化反应4实验步骤新鲜菠菜叶片，去掉中脉后的样品称重(约2-3g,记录样品重量)；剪碎入研钵中，加少量石英砂和碳酸镁粉及2-3ml的95%乙醇，研磨匀浆，再加乙醇混匀；过滤到25ml容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣，最后连同残渣一起过滤（直至滤纸和残渣中无绿色为止）最后用乙醇定容至25ml(后称原液)，摇匀。4.1叶绿素的提取4.2叶绿素的荧光取3ml叶绿素提取原液，观察其透射光、反射光下的颜色；