叶绿素的提取与分析测定.pdf

植物叶绿体色素的分析 一、实验目的： 1、学会叶绿体色素的分离方法。 2、掌握叶绿素的定量测定。一、 3、了解高等植物叶绿体色素的种类组成、性质。 二、实验原理： 1 1 11、叶绿体色素的提取： 1 1 （11）原理： 叶绿体色素是植物捕获太阳能进行光合作用的重要物质，高等植物的叶绿体色素一般 由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素等组成。 叶绿体色素的提取是利用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性,将待测的植物叶片用研 钵研磨让植物组织破碎，利用丙酮的溶解能力将叶绿体色素溶于丙酮中，通过用滤纸过滤 分离植物组织碎片，即可以得到叶绿体色素的丙酮粗提液。 2 2 （22）步骤： 称取新鲜的植物叶子(菠菜等)4g，放入研体中加5ml80%丙酮，少许碳酸钙和石英砂, 研磨成匀浆,再加入20ml 丙酮，以漏斗过滤到棕色瓶中备用 2 2 22、叶绿体色素的分离： 1 1 （11）原理： 叶绿体色素的分离提纯一般用层析的方法，其中纸层析是最简单的一种。 当溶剂不断地从纸上流过时，由于混合物中各成分在流动相和固定相间具有不同的分 配系数，引起它们的移动速度不同，因而使混合物分离。 2 2 （22）步骤： 1）取滤纸条(6.5×30cm),在离纸边1.5cm处用铅笔划一直线，在另一端两角分别拴上一根线 (见图1)，用毛细管取吸绿素提取液沿着铅笔线划一条样带，使样带宽度在3mm以内， 如色素过淡用电吹风吹干后再点数次，直到样带呈深绿色为止。 2）在层析缸中加入四氯化碳20ml及少许无水硫酸钠,然后将滤纸吊在层析缸中,使下端浸入 溶剂中,色素点要略高于液面,滤纸条边缘不可碰到层析缸璧(如图2)用聚乙烯薄膜两层封 住层析缸,直立于暗处层析。 3）0.5小时后，观察色素带分布(最上端是橙黄色的胡萝卡素，其次是黄色的叶黄素，然后 是兰绿色的叶绿素a 和黄绿色的叶绿素b)，记录色谱图。 如图所示： 3 3 33、叶绿体色素的性质 （一）荧光现象：叶绿体色素在吸收光能以后可以从基态跃迁到激发态，当处于第一单线态 （激发态）的电子再回到基态时其携带的能量将以光的形式放射出来产生荧光，叶绿素荧光 的颜色是红色的。由于荧光的光强度很弱只能在反射光的方向可以看到。如果我们将提取液 放入试管中，观察反射光和透射光的颜色，反射光的颜色即为叶绿素产生荧光的颜色为血红 色。【如右图：】 （二）氢代叶绿素铜代叶绿素： C55H72O5N4Mg + H+ ===C55H74O5N4 + Mg++ H+C55H72O5N4Mg +Cu++ ===C55H72O5N4 Cu +Mg++ 叶绿素取上述提取液少许于试管中，加入 2滴浓盐酸，溶液呈现褐 绿色，此时叶绿素变为去镁叶绿素。在褐绿色溶液中加入醋酸铜结晶少 许，渐渐加热直至鲜绿色产生，这时铜已在叶绿素分子中代替了Mg 的 位置。 � （三）皂化作用： 叶绿素是含有两个酸根的酯，加碱可发生皂化反应，得到叶绿酸的盐、甲醇和叶绿醇， 叶绿酸盐可溶于水。 取3ml色素提取液，加lm120%KOH 甲醇溶液,小心加热到沸腾,冷却后,加入2ml苯,混匀， 加入3m1 水静止后得到两层溶液,上层是苯的胡萝卜素和叶黄素溶液，下层是叶绿酸a 和叶绿 酸b 的钾盐溶液。 另外在3ml上述色素提取液中直接加2ml苯，混匀，加入3ml水，对比皂化和没皂化溶液 有何不同。照相记录实验结果。 （左图为皂化溶液，右图没皂化） 4 4 44、叶绿体色素的定量分析： 叶绿体色素能够吸收一定波长的光，而让其他波长的光透过，这是叶绿体色素的光学特征之 一,将色素的吸光度对波长作图，所绘制的曲线称