叶绿体色素的提取、分离，测定叶绿素a、b含量.doc

实验四 、叶绿体色素的提取、分离及 叶绿素a、b含量的测定 刘家富 05生科（一） 一、实 验 原 理 1.脂溶性叶绿体色素提取： 可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。 2.分离： （1）叶绿体色素的分离＜纸层析法＞ 　　　因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各种成分在两相（固定相和流动相）间具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后，可将各种色素分开。 　　　纸层析是以滤纸纤维为固定相，而以有机溶剂作为流动相。由于样品中各物质有不同的分配系数，移动速度因此而不同，从而达到分离的目的。 （2）叶绿素与类胡萝卜素的分离皂化反应 叶绿素是一种二羧酸——叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成醇与叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开。 3.叶绿素a、b含量的测定： 根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其溶液浓度c和液层厚度L成正比，即：A=φCL(φ为吸光系数)因此，根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其吸光度，用公式即可计算出提取液中各色素含量。 测定663nm和645nm两个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b在对应波长下的吸光系数即可求出叶绿素a、b含量。其校正过的公式为： Ca＝12.7A663－2.69A645 Ca:叶绿素a浓度,mg/L Cb＝22.9A645－4.68A663 Cb:叶绿素b浓度,mg/L CT＝Ca + Cb CT:叶绿素总浓度,mg/L 二、仪 器 药 品 剪刀、漏斗、烧杯、分光光度计、分液漏斗、铁架台、移液管、吸耳球、试管、毛细管、平底大试管、石英砂、碳酸钙、丙酮、乙醚、四氯化碳、无水硫酸钠、30%KOH-甲醇溶液、天平、研钵、滤纸 三、操 作 步 骤 1. 叶绿体色素的提取 取去中脉叶片（2g左右），剪碎后加入少量石英砂、碳酸钙、纯丙酮5ml后放入研钵研磨成匀浆成深绿色提取液，之后用漏斗过滤。 2.叶绿体色素的分离（纸层析法） ⑴制备： 长条滤纸(宽2*20cm)，将其一端剪去两侧，中间留一0.5*1.5cm的窄条。 ⑵点样： 用毛细滴管吸取叶绿素溶液在窄条的上方点样(少量多次), 在平底试管中加推动剂3-5mL(四氯化碳+少量无水硫酸钠)，把长条滤纸一端挂在橡胶塞下的大头针上，调节长度使纸条下端的窄条浸入推动剂中，注意色素点不可浸入。 ⑶观察： 等到推动剂扩散至滤纸条上沿约2cm时,取出滤纸，铅笔标明推动剂边缘，观察分离后色素带的分布。 3.叶绿素的理化性质 ⑴荧光现象观察 取上述色素丙酮提取液少许于试管中，观察在反射光和透射光一侧提取液的颜色有无不同。 ⑵铜代反应 取上述色素丙酮提取液少许于试管中，逐滴加入浓盐酸，直至溶液出现褐绿色；此时再加入醋酸铜晶体少许，慢慢加热溶液。 仔细观察，记录实验现象并解释原因。 4.叶绿素和类胡萝卜素的分离（皂化作用 取色素提取液（约10ml）放入加了10ml乙醚分液漏斗中，再加入20ml蒸馏水摇动。静置一会，溶液分两层，上层为色素＋乙醚（用蒸馏水冲洗1~2次），下层为丙酮＋水（弃去）。然后再加入5ml 30%KOH甲醇溶液用力摇动静置10分钟后加入5ml蒸馏水摇动静置分离，溶液分为两层。 5. 叶绿素ａ和ｂ含量的测定（分光光度法） ⑴称取新鲜叶片（避开叶脉）0.5g，加纯丙酮3ml和少许碳酸钙、石英沙研磨成匀浆，转入离心管，用适量80%丙酮洗涤研钵，一并转入离心管，离心后弃沉淀，上清液用80%丙酮定容至10ml。 ⑵取上述色素提取液1ml，加80%丙酮4ml，混匀后转入比色皿，以80%丙酮为参比，分别测定663nm、645nm处的光密度值。 6.照公式计算色素提取液中叶绿素a/b以及a+b的浓度；再根据稀释倍数分别计算每克鲜重叶片中色素的含量。 波长 吸光度 645nm A645=? 6