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【2017年整理】 单克隆抗体制备操作方法及注意事项- JEN.doc

发布:2017-01-14约字共27页下载文档
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无菌室清洁要求:1、进入无菌间,须更换白大褂,口罩、鞋套必须戴上,最好戴上帽子、手套; 2、进去后用酒精棉球擦洗手; 3、生物安全柜常用酒精棉球擦洗,擦后棉球不显黑;柜内垃圾当日及时清理;柜内所有实验操作应在酒精灯前进行;经常紫外杀菌; 4、无菌间物件传递,经窗口紫外照射方可; 5、有关试剂使用后及时用封口膜封住; 6、细胞培养盖子旋松,以便二氧化碳气体进入;拿瓶、加液体均需注意瓶口,避免污染瓶盖; 7、出门后需要用钥匙锁上; 8、整个无菌间两周清洁一次; 免疫动物:选择与瘤细胞同一品系的动物做为免疫对象,现在常用的是Balbc/c小鼠,6-8周龄,一种抗原一次性注射2-3只小鼠,小鼠不宜过大,雌性相对较好; 首次注射抗原100微克与等体积弗氏完全佐剂混匀,在背部两侧皮下与腹腔分别注射,形成几个小泡; 间隔两周左右时间(14天) 二次免疫注射抗原50微克与等体积弗氏不完全佐剂混匀,在背部皮下及腹腔分别注射,通常上次背部小泡仍然存在; 间隔两周左右时间(14天) 三免小鼠注射抗原50微克与等体积弗氏不完全佐剂混匀,在背部皮下及腹腔分别注射,通常上次背部小泡仍然存在; 间隔7-10天左右时间 尾部采血测定抗体效价: 方法一:手拇指和食指从背部抓住小鼠颈部皮肤,将小鼠头朝下,小鼠保定后将其尾巴置于50°热水中浸泡数分钟,使尾部血管充盈。擦干尾部,再用剪刀或刀片剪去尾尖1~2mm,用试管接流出的血液,同时自尾根部向尾尖按摩。取血后用棉球压迫止血并用6%液体火棉胶涂在伤口处止血。每次采血量0.1ml。固定小鼠用温水(水温约50度左右)泡大约2分钟,这样能使血管充分舒张。用干棉球擦干静脉穿刺选择尾部中下2/3~1/2处比较好,从下向上扎万一一次扎不进,还可以继续使用此血管。左手食指和中指上下夹注你所选择血管的靠近身体的一边,无名指和小指垫起一块纱布或者纸巾(建立一个穿刺的平面的作用),拇指压住所选血管的尾尖端,上下夹住血管的距离应以不影响右手持针上下移动为宜.(否则容易人为建立穿刺的角度,而使右手持穿刺针穿刺过深,导致穿刺失败.)右手持穿刺针,稍微挑起皮肤一点,就可以平着进针,看到回血表明成功,还可以回抽,见到回血后表明穿刺已进入血管,可以给药.穿刺结束后,用纱布压住穿刺部位反折尾部进行止血.良好并彻底的止血对于血管可以起到很好的保护作用,这对于需要天天穿刺给药是非常有用的(一般小鼠需要按压时间很长,否则易引起出血)—1ml),在管子上面注明日期、名称,先在4度中静置数小时,再在液氮液面上悬30—60min,之后放入液氮中冻存; 7、复苏,拉线取出冻存管,用漂悬浮在盛有37度水的烧杯,烧杯置于水浴锅中,待融化后转移到含有新鲜培养基的细胞培养瓶中混匀,进行培养,在次日一定要更新培养基,去除DMSO,以有利于后续的培养; 8、 细胞融合时,将3瓶生长良好的细胞液转移在50ml离心管中,1000rpm 10min,弃上清;加30ml DMEM 离心洗涤一次,加10ml 重悬混匀,血细胞计数板计数备用; 在实际培养中,大概三天后细胞基本可以长满,四天开始出现细胞死亡情况,五天后有半数细胞死亡,六天后大部分死亡。 HAT培养液浓度选择 商品化HAT多为50×,先用不完全培养基溶解后(10ml一管),按比例加到完全培养基中制成HAT培养基;HAT一般含量偏高,做梯度培养瘤细胞实验选择合适的HAT培养液浓度; 用24孔板和SP2/0进行 在各孔中加等体积的培养液,培养细胞,待长成单层细胞后依照下表添加不同量的HAT培养观察死亡情况; 2 1.5 1.0 0.75 0.5 0.25 2 1.5 1.0 0.75 0.5 0.25 2 1.5 1.0 0.75 0.5 0.25 2 1.5 1.0 0.75 0.5 0.25 选择第一天死亡半数细胞;第二天死亡大部分细胞;第三天全部死亡的浓度; 在实际试验中,不同梯度的HAT均可导致瘤细胞的快速死亡,具体试验可选用2%,亦可选用1%; 饲养细胞制备 在细胞融合前,三天内购买Balb/c或KM小鼠2-3只(个体易较大),在细胞融合当天制备饲养细胞; 器材与试剂:解剖工具、5ml玻璃注射器、96孔板、50ml离心管、血细胞计数板、HAT培养液、75%的酒精、250ml烧杯; 操作方法: 将小鼠摘眼球或拉颈脱臼处死,浸泡在75%酒精中5min,随即放入超净台内,小鼠腹部朝上; 酒精棉球腹部擦拭消毒,用止血钳将腹部皮肤拉开,完全露出腹膜; 镊子小心提起小鼠腹部皮肤,注射5ml DMEM溶液,轻轻按摩腹部1-2分钟; 用注射器吸出腹腔内液体,转于50ml离心管中,1000rpm, 10min,弃上清液; 用5ml HAT培养液重悬沉淀,细胞计数,补加液体至细胞浓度为2*105个/ml; 加在96孔板中,每
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