【2017年整理】单克隆抗体制备方法(全).doc

单克隆抗体制备方法1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。采用杂交瘤技术制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤。主要仪器设备：超净工作台、CO2恒温培养箱、超低温冰箱（-70℃）、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、离心机（水平转子，4000r/min）、37方法动物的选择与免疫1. 动物的选择BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。2. 免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。初次免疫 抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点）↓3周后第二次免疫 剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml）↓3周后第三次免疫 剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价）↓2～3周加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射）↓3天后　　取脾融合目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。（2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞。初次免疫 1×107/0.5ml ip4 G+ X7↓2～3周后第二次免疫 1×107/0.5ml↓3周后加强免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv↓9取脾融合T细胞融合细胞融合前准备. 骨髓瘤细胞系的选择：骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。常用的骨髓瘤细胞系见下表。用于融合试验的主要骨髓瘤细胞系名称来源耐药Ig链H LP3/X63-Ag8(X63), j: I7 M) z* ?# P I6 R! nBALB/C骨髓瘤MOPC-210 h! f. {8 y7 |5 Y??A/ Q??E) K( H??N3 `8-氮鸟嘌呤9 P p. E, w( W3 p) J- W8 R |r1 　K/ O9 G- {+ j% Y5 J7 F4 pP3/X63-Ag8.653(X63-Ag8.653) E1 ?5 V u; f6 Y6 R L# V3 O2 iP3/X63-Ag86 N/ Q( J$ w3 `3 h8 ~; B: Z$ G8-氮鸟嘌呤 q i- N5 M. H???( p$ S; e9 J－( O1 v Z3 D a6 d! g??V8 E－8 r5 Y9 ^: M2 B \0 ~6 QP3/NSI-1-Ag4-1(NS-1). Y+ V+ D; Z6 p N9 @1 d T; c yP3/X63-Ag83 f# t; Q$ b* n??E3 @/ y+ O c8-氮鸟嘌呤* B6 {6 j9 o??]( h, S- H0 W－ K（不分泌型）7 ]. L) O??a [6 |/ WP3/X63-Ag8.Ul(P3Ul)+ X0 Y e8 ~, m4 s（X63×BALB/C脾细胞）杂交瘤??p; ?+ m7 D+ h. g9 W! A5 f2 I8-氮鸟嘌呤8 X5 H# e! X% g3 d( S# l－- o- m# `: N: M( z$ h－$ X( c/ {: L+ f5 f5 Q5 _8 OSP2/0-Ag14(SP2/0)8 v7 q1 ?5 O- P+ c2 {（X63×BALB/C脾细胞）杂交瘤+ s# W2 w6 U3 O) q8-氮鸟嘌呤5 k4 V! n* ^! T, ]??N; z/ |) m－ h5 m A9 o+ { u5 o－9 M$ w; l. r. g% ^F0. ^ Z. R# U$ p, d$ s, O3 KBALB/C骨髓瘤0 Q: y% y [. A6 y8-氮鸟嘌呤/ V9 i+ `/ B* r {/ j( S% C－7 J1 h H;